Summary
Den foreliggende rapporten detaljene protokollen ansatt for å måle givende effektene av høy-fett mat i mus ved hjelp av en progressiv ratio operant conditioning oppgave.
Abstract
Matvarer som er rike på fett og sukker i vesentlig grad bidrar til over-spising og økende forekomst av fedme. Forbruket av spiselig mat kan produsere en givende effekt som styrker action-utfall foreninger og styrker fremtidig atferd rettet mot å skaffe disse matvarene. Økende bevis for at det givende effektene av energitette matvarer spiller en dyp rolle i overspising og utvikling av fedme har økt interessen for å studere gener, molekyler og nevrale kretser som modulerer mat belønning 1,2. Den givende virkningen av ulike stimuli kan studeres ved å måle vilje til å arbeide for å oppnå dem, for eksempel i operant betinging oppgaver 3. Operante modeller av mat belønning tiltaket ervervet og frivillige atferdsmessige responser som er rettet mot å skaffe mat. Et vanlig mål belønning styrke er en operant prosedyre kalt progressiv ratio (PR) tidsplan for armering. 4,5 i PR tspør, er faget kreves for å lage et økende antall operante responser for hver påfølgende belønning. Den banebrytende studie av Hodos (1961) viste at antall responser gjort å få den siste belønning, kalt stoppunkt, fungerer som en indeks for belønning styrke 4. Mens operante prosedyrene som måler endringer i svarprosent alene ikke kan skille endringer i belønning styrke fra endringer i ytelse kapasitet, er det stoppunkt utledet fra PR tidsplanen et godt validert mål på det givende effektene av mat. PR oppgaven har vært brukt mye til å vurdere givende virkningen av narkotika misbruk og mat i rotter (f.eks 6-8), men i mindre grad i mus 9. Den økte bruken av genmanipulerte mus og diett-indusert overvektige musemodeller har økt kravene til atferdsmessige tiltak av mat belønning i mus. I den foreliggende artikkelen detalj vi materialer og prosedyrer som brukes til å trene musene til å svare (spak-trykk) for et fettriktog høy-sukker mat pellets på en PR tidsplan av armering. Vi viser at stoppunkt respons terskler øke ved akutt mat savn og minke med perifer administrasjon av anorektiske hormonet leptin og dermed validere bruk av denne mat-operant paradigmet i mus.
Protocol
* Mest viktige skritt.
1. Utstyr og programvare
- Opplæring og testing blir utført i mus operante kamre utstyrt med to ultra-lette, uttrekkbar hendler 1 plassert på hver side av en mat stikkontakt (se tabell 1). En stimulus lampen er plassert over hver spak, og det er et hus lys på toppen av buret. En pellet dispenser ligger utenfor kammeret. Hvert kammer ligger inne i en lyd-demping bås med ventilerende fan. Chambers er koblet til en PC med MedPC IV programvare via en "Smart Control" grensesnitt skap.
Merk: Når ultralette spakene er ikke tilgjengelig, anbefales det at nese-sekken brukes som operant respons for mus studier. Men med begge alternativene foreslår vi utvalg av ultralette hendler som en mer pålitelig mål på motivasjon gitt at nese-stikk svar kan be utløst av utforskende sniffing.
- De MedPC programmer som brukes til å kjøre operante oppgaver er skrevet i Medstate notasjon kode som en bruker kan lære ved hjelp av programmeringsspråket manualen som følger med. Programmering gir fleksibilitet for brukeren å endre eksisterende koder eller generere unike eksperimentelle parametre. Visse koder kan fås gratis fra Med Associates "Medstate Notation Repository" http://www.mednr.com . Ytterligere koder kan kjøpes fra Med Associates.
2. Mus Akklimatisering og mat begrensning
- Ved ankomst mus er gruppe-huset i minst 10 dager for å akklimatisere til en omvendt 12 h lys / mørke-syklusen og utstyrt med ad libitum tilgang til standard chow og vann. I vårt tilfelle bruker vi voksne C57BL / 6 mus kjøpt fra Charles River (St. Constant, QC). Alle mus manipulasjoner og atferdsmessige eksperimenter utføres i den mørke syklusen. All proprosedyrer som involverer bruk av dyr ble godkjent av CRCHUM Animal Care komité.
- Mus blir senere enkeltvis-huset og mat begrenset (70% av deres daglige matinntak) inntil de når 90-95% free-fôring kroppsvekt for å lette oppkjøp av spak-pressen svare. Mus ble gitt sin daglige kvote av mat i hjemmet buret etter avslutning av økten. Fra fylte 5-10% vekttap, er den daglige maten tildelt justert for å stabilisere de lavere kroppsvekt for resten av opplæringsperioden. Når mus har oppnådd oppkjøp kriterier (se nedenfor) de blir satt på en ad libitum fôring planen. Mus gjenvinne tapt kroppsvekt i ca 3-4 dager.
- Mus blir håndtert i testrommet i 3 påfølgende dager før første trening. Dagen før starten av treningen 10-15 høy-fett og høyt-sukker (HFHS) pellets blir plassert inn i hjemmet buret for å hindre potensielle påvirkning av mat neophobia på operant performance. Vi bruker 20 mg HFHS og støvfrie, presisjon mat pellets (14 mg også tilgjengelig) inneholder 48,9% Kcal som fett (Bio Serv, Frenchtown, NJ).
3. Operant Opplæring
- Mus er i utgangspunktet trent til å trykke spaken på et fast ratio (FR) -1 forsterkning tidsplan der en ettgreps trykk utløser levering av mat pellets til stikkontakten. Bare én spak er utpekt som "aktiv" (utløsning levering av mat belønning) og tildeling av høyre og venstre spakene er oppveies mellom mus. Det er viktig å legge til minst en 5 andre timeout (TO) til FR1 tidsplan (FR1/TO-5), hvor ytterligere spak-trykke ikke resulterer i levering av mat pellet. Dette for å perioden gir tid for mus å konsumere maten pellets, kan imidlertid lengre out'er brukes hvis eksperimentator mener det er nødvendig for deres mus modell. Hver FR treningsøkt varer en time eller når 50 pellets har blitt levert.
- * Kjøp Kriterier: </ Strong> Kriteriene som brukes for å avgjøre kjøp av mat vedlikeholdt operant respons omfatter: (1) et minimum antall aktive responser og belønninger opptjent, (2) et mål på diskriminering mellom aktive og inaktive spakene, og (3) mellom øktene ytelse stabilitet. Mus stiller diskriminering på ≥ 3:1 for den aktive versus inaktive spaken og få ≥ 20 premier per økt over tre påfølgende økter anses å oppnå oppkjøp kriterier 10. Vi har observert at de fleste (~ 75%) av C57BL6 mus krever ca 7-10 dager med trening for å oppnå oppkjøp kriterier. Mus som ikke når oppkjøpet kriterier på dette tidspunkt gjennomgå ytterligere trening i ytterligere 5-7 dager. Vi utelukker mus fra testing (~ 5% av tilfellene) når det ikke er fremgang med ekstra femte treningsdag. Det er viktig å huske på at svekket operant oppkjøpet kan være et resultat av visse farmakologiske og genetisk intervensjoner og bør derfor dokumenteres. </ Li>
- Etter tre påfølgende økter for å skaffe ≥ 20 pellets, er tidsplanen økt til FR5/TO-5 sekunder der 5 aktive spak presser utløse levering av maten pellet. Trening på FR5 timeplanen varer i tre dager.
- * Musene er så trent i den progressive ratio (PR) timeplan med armering. Responsen ratio tidtabell under PR testing kan beregnes som per Richardson og Roberts (1996) 11 med følgende formel (avrundet til nærmeste heltall):
= [5 e (R * 0,2)] - 5
der R er lik antall av mat belønninger allerede opptjente pluss 1 (dvs. neste forsterker). Dermed blir antall svar som kreves for å tjene en mat belønning følge rekkefølgen: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 og så videre. Den endelige forholdet avsluttet er stoppunkt. - En PR økt varer maksimalt en time. Unnlatelse av å trykke spaken i noen 10 min periode resulterer i oppsigelse av økten. PrestaMance på PR planen av armering anses å være stabilt når antallet belønninger opptjent i en 1 times session avviker med ≤ 10% i minst 3 påfølgende dager.
4. Progressiv Ratio Testing og validering
- For å validere mat vedlikeholdt operant svare på PR oppgaven, kan man vurdere stoppunkt svarer følgende manipulasjoner kjent for å modulere mat belønning. En relativt enkel test å utføre er mat deprivasjon som vil øke motiverende tilstand musen for mat og dermed øke stoppunkter. Mus må først bli testet i PR oppgaven i løpet av en periode på ad libitum fôring fram til stabil, baseline ytelse oppnås. Dagen etter den siste "baseline" dag mat blir fjernet fra hjemmet buret og mus blir deretter testet i PR oppgaven 24 timer etter starten av den raskt.
- Vi har også undersøkt om perifer administrasjon av anorektiske hormonet leptin ville ha motsatt effekt på stoppunktterskler. Leptin (AF Parlow, National Hormone og Peptide Program, NIDDK) ble oppløst i sterilt PBS. PR testing ble utført etter en IP injeksjon av PBS den ene dagen og deretter følge injeksjon av leptin (5 mg / kg) neste dag. Leptin ble injisert en time før PR testing. Stoppunkter ble sammenliknet med en paret t-test (GraphPad Prism).
5. Representative Resultater
Når du skal teste muligheten av mat deprivasjon å modulere stoppunkt svare på en PR tidsplan av armering, forventer vi en kraftig økning stoppunkter som vist i Figur 1. I dette eksperimentet en 24 timers periode på mat deprivasjon produsert en ~ 3,6-fold økning i stoppunkter sammenlignet med de som ble oppnådd i det frie fôring baseline staten dermed tyder på at mat deprivasjon øker givende effektene av mat. I kontrast, perifer administrasjon av anorektiske hormonet leptin (5 mg / kg, IP) en time før testing bør redusere stoppunkt reagere som vist i Figur 2.
Figur 1. Fasting øker givende effektene av mat. En 24 t rask betydelig økt stoppunkter på en progressiv ratio (PR) tidsplan av armering i mus (n = 4). Mean ± SEM, * p <0,05.
Figur 2. Leptin avtar mat belønning i mus. Peripheral leptin administrasjon (5 mg / kg) reduserte PR stoppunkt respons terskler i mus (n = 4). Mean ± SEM, * p <0,05.
Discussion
Operant betinging oppgaver gi en effektiv måte å vurdere endringer i de motiverende egenskaper mat. De eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i denne artikkel tillatelse trening mus til spaken pressen for mat belønninger og stabilt svare på en PR tidsplan av armering.
Måle mengden av mat som forbrukes gir ikke den samme avlesning som innsats-baserte respons tiltak siden ikke alle faktorer som påvirker matinntaket modulere givende effektene av mat. For eksempel tappe utilizable glukose ved perifer 2-deoxyglucose administrasjon hos rotter øker mengden av fritt tilgjengelig mat som forbrukes, men unnlater å endre brytepunkter i en PR oppgave for mat 12. PR stoppunkt reagerer også kan reflektere endringer i kvaliteten på maten belønninger. For eksempel er brytepunkter positivt korrelert med sukrose konsentrasjon viser at motivasjonen for sukrose øker på en måte som følger søt smak 8 12-14.
Når du bruker denne protokollen er det viktig å huske på at kjøp av mat vedlikeholdt operant respons er betydelig forbedret av regelmessig trening (hver 1-2 dager) og ved å øke motiverende tilstand av musen ved å implementere en mat begrensning regime. I tillegg sikre at mus viser relativt stabilt svare på en forsterkning timeplanen før du går videre til mer komplekse planer (f.eks FR1 til FR5) er nøkkelen til å redusere variabel ytelse under testing. Til tross for anvendelse av disse trinnene, er det ikke uvanlig å få litt variasjonspesielt mellom forskjellige mus. Av denne grunn er det sterkt anbefalt å bruke en i-fag (repeterte målinger) design når det er mulig å fjerne hele variasjon. Selv innen-faget testing er ikke mulig for å undersøke stabile genetiske modifikasjoner (dvs. knockout versus kontroll mus) det kan brukes til å undersøke påvirkning av narkotika, skader eller akutte genetiske (f.eks optogenetic) manipulasjoner.
Fedme og overvekt-relaterte sykdommer er et økende problem som har økt det haster å identifisere molekyler og nervebaner som er involvert. Innsamling av bevismateriale fremhever den viktige rollen hjernen belønning kretser i mat ute, økt kaloriinntak og vektøkning. PR Oppgaven er et verdifullt verktøy for å måle virkningen av nevrobiologiske, genetisk eller farmakologisk manipulasjoner på det givende effekter av mat.
Disclosures
Produksjon og fri tilgang til denne video-artikkelen er sponset av Med Associates, Inc.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (355 881) og Canadian Foundation for Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse operant chambers |  Med Associates, Inc. |
ENV-009A | Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Phone: (802) 527-2343 |
| 8 inputs/16 inputs Smart Control Connection Panel | Med Associates, Inc. |
SG-716B | |
| Ultra-light retractable mouse lever | Med Associates, Inc. |
ENV-312 | |
| Pellet Dispenser | Med Associates, Inc. |
ENV-203 | |
| House Light | Med Associates, Inc. |
ENV-215 | |
| Stimulus Light | Med Associates, Inc. |
ENV-221 | |
| Dust-free Precision 20 mg high-fat & high-sugar pellets | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Phone: (800)-996-9908 |
| Table 1. Specific equipment and material | |||
References
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
