وهناك طريقة سريعة لتعديل جينوم<em> V. الكوليرا</emيوصف>. وتشمل هذه التعديلات حذف الجينات واحد، مجموعات الجينات والجزر الجيني وكذلك التكامل من متواليات قصيرة (على سبيل المثال عناصر المروج أو تسلسل النسب، علامة). وتستند هذه الطريقة على التحول الطبيعي وإعادة التركيب FLP.
تتوفر العديد من الطرق لمعالجة الكروموسومات البكتيرية 1-3. معظم هذه البروتوكولات تعتمد على إدخال البلازميدات تنسخي مشروط (مثل إيواء replicons البير التي تعتمد على درجة الحرارة أو تراعي 1،2). يتم دمج هذه البلازميدات البكتيرية في الكروموسومات تقوم على التماثل بوساطة إعادة التركيب. وغالبا ما تكون مثل هذه المسوخ غرزي استخدامها مباشرة في إعدادات التجريبية. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء الختان لاختيار البلازميد تليها خسارتها، والتي لالجراثيم سلبية الغرام تعتمد في أغلب الأحيان على انزيم مكافحة اختيار سكراز ليفان المشفرة بواسطة الجينات هيئة تنسيق المعونة 4. يمكن للالختان إما استعادة النمط الجيني ما قبل الإدراج أو تؤدي إلى تبادل بين كروموسوم ونسخة بلازميد ترميز الجين المعدلة. عيوب هذا الأسلوب هو أنه يستغرق وقتا طويلا. البلازميد لابد من استنساخ الأولى؛ أنه يتطلب نقل الأفقي إلى V. الكوليرا (ن معظم otably من التزاوج مع E. سلالة الإشريكية المانحة) أو التحول الاصطناعي لهذه الأخيرة؛ واستئصال البلازميد هو عشوائي ويمكن إما استعادة النمط الجيني الأولي أو إنشاء التعديل المطلوب إذا لم يمارس اختيار إيجابية. هنا، نقدم طريقة للتلاعب السريع للV. الكوليرا كروموسوم (ق) 5 (الشكل 1). ويستند هذا الأسلوب على تحريض TransFLP كيتين بوساطة اكتشفت مؤخرا من الكفاءة الطبيعية في هذا الحي ممثل 6 و أخرى من جنس الضمة مثل V. fischeri 7. الكفاءة الطبيعية يسمح للامتصاص الحمض النووي DNA مجانا بما في ذلك شظايا ولدت PCR. تؤخذ مرة واحدة حتى، ويعيد توحيد DNA مع كروموسوم معين وجود ما لا يقل عن 250-500 من بي بي المرافقة مثلي المنطقة 8. منها علامة الاختيار في الفترات الفاصلة بين هذه المناطق المحيطة يسمح الكشف سهولة transformants التي تحدث في كثير من الأحيان.
ر "> ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجات وراثية مختلفة من الكوليرا V. وربما غيرها أيضا البكتيريا المختصة بشكل طبيعي. نحن نقدم أمثلة ثلاثة على رواية ما يمكن تحقيقه باستخدام هذا الأسلوب بالإضافة إلى دراستنا المنشورة سابقا على الحذف جين واحد وعلى إضافة علامة تقارب-متواليات 5. يتم دمج عدة خطوات التحسين بشأن بروتوكول الأولي من الكيتين التي يسببها التحول الطبيعي 6 في هذا البروتوكول TransFLP. وتشمل هذه وغيرها استبدال شظايا قذيفة السلطعون من رقائق كيتين المتاحة تجاريا 8، على التبرع PCR المستمدة من الحمض النووي وتحويل المواد 9، وإضافة المواقع المستهدفة FLP-إعادة التركيب (FRT) 5. مواقع FRT يسمح الختان الموقع موجه للعلامة الاختيار بوساطة recombinase FLP 10.وصف طريقة TransFLP أعلاه وغيرها وقد تم على نطاق واسع 5 المستخدمة في مختبرنا. هذا النوع من التلاعب الجيني التي هي ممكنة، ضمن جملة أمور: حذف الجينات واحد ومجموعات الجينات، حذف الجزر الجيني (على سبيل المثال، VPI-1)، إدراج تسلسل المنبع من الجين في المصالح (على سبي…
The authors have nothing to disclose.
وأود أن أنوه أولغا سيلفا دي سوزا للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم السويسري (SNSF) منحة 31003A_127029.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |