TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا<em> ضمة الكوليرا</em> بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP
Summary
وهناك طريقة سريعة لتعديل جينوم<em> V. الكوليرا</emيوصف>. وتشمل هذه التعديلات حذف الجينات واحد، مجموعات الجينات والجزر الجيني وكذلك التكامل من متواليات قصيرة (على سبيل المثال عناصر المروج أو تسلسل النسب، علامة). وتستند هذه الطريقة على التحول الطبيعي وإعادة التركيب FLP.
Abstract
تتوفر العديد من الطرق لمعالجة الكروموسومات البكتيرية 1-3. معظم هذه البروتوكولات تعتمد على إدخال البلازميدات تنسخي مشروط (مثل إيواء replicons البير التي تعتمد على درجة الحرارة أو تراعي 1،2). يتم دمج هذه البلازميدات البكتيرية في الكروموسومات تقوم على التماثل بوساطة إعادة التركيب. وغالبا ما تكون مثل هذه المسوخ غرزي استخدامها مباشرة في إعدادات التجريبية. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء الختان لاختيار البلازميد تليها خسارتها، والتي لالجراثيم سلبية الغرام تعتمد في أغلب الأحيان على انزيم مكافحة اختيار سكراز ليفان المشفرة بواسطة الجينات هيئة تنسيق المعونة 4. يمكن للالختان إما استعادة النمط الجيني ما قبل الإدراج أو تؤدي إلى تبادل بين كروموسوم ونسخة بلازميد ترميز الجين المعدلة. عيوب هذا الأسلوب هو أنه يستغرق وقتا طويلا. البلازميد لابد من استنساخ الأولى؛ أنه يتطلب نقل الأفقي إلى V. الكوليرا (ن معظم otably من التزاوج مع E. سلالة الإشريكية المانحة) أو التحول الاصطناعي لهذه الأخيرة؛ واستئصال البلازميد هو عشوائي ويمكن إما استعادة النمط الجيني الأولي أو إنشاء التعديل المطلوب إذا لم يمارس اختيار إيجابية. هنا، نقدم طريقة للتلاعب السريع للV. الكوليرا كروموسوم (ق) 5 (الشكل 1). ويستند هذا الأسلوب على تحريض TransFLP كيتين بوساطة اكتشفت مؤخرا من الكفاءة الطبيعية في هذا الحي ممثل 6 و أخرى من جنس الضمة مثل V. fischeri 7. الكفاءة الطبيعية يسمح للامتصاص الحمض النووي DNA مجانا بما في ذلك شظايا ولدت PCR. تؤخذ مرة واحدة حتى، ويعيد توحيد DNA مع كروموسوم معين وجود ما لا يقل عن 250-500 من بي بي المرافقة مثلي المنطقة 8. منها علامة الاختيار في الفترات الفاصلة بين هذه المناطق المحيطة يسمح الكشف سهولة transformants التي تحدث في كثير من الأحيان.
ر "> ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجات وراثية مختلفة من الكوليرا V. وربما غيرها أيضا البكتيريا المختصة بشكل طبيعي. نحن نقدم أمثلة ثلاثة على رواية ما يمكن تحقيقه باستخدام هذا الأسلوب بالإضافة إلى دراستنا المنشورة سابقا على الحذف جين واحد وعلى إضافة علامة تقارب-متواليات 5. يتم دمج عدة خطوات التحسين بشأن بروتوكول الأولي من الكيتين التي يسببها التحول الطبيعي 6 في هذا البروتوكول TransFLP. وتشمل هذه وغيرها استبدال شظايا قذيفة السلطعون من رقائق كيتين المتاحة تجاريا 8، على التبرع PCR المستمدة من الحمض النووي وتحويل المواد 9، وإضافة المواقع المستهدفة FLP-إعادة التركيب (FRT) 5. مواقع FRT يسمح الختان الموقع موجه للعلامة الاختيار بوساطة recombinase FLP 10.Protocol
Representative Results
Discussion
وصف طريقة TransFLP أعلاه وغيرها وقد تم على نطاق واسع 5 المستخدمة في مختبرنا. هذا النوع من التلاعب الجيني التي هي ممكنة، ضمن جملة أمور: حذف الجينات واحد ومجموعات الجينات، حذف الجزر الجيني (على سبيل المثال، VPI-1)، إدراج تسلسل المنبع من الجين في المصالح (على سبي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأود أن أنوه أولغا سيلفا دي سوزا للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم السويسري (SNSF) منحة 31003A_127029.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. . Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
