Um método rápido para modificar o genoma de<em> V. cholerae</em> É descrito. Essas modificações incluem a eliminação de genes individuais, grupos de genes e ilhas genômicas, bem como a integração de seqüências curtas (por exemplo, elementos promotor ou afinidade tag-seqüências). O método baseia-se na transformação de recombinação natural e FLP.
Vários métodos estão disponíveis para manipular cromossomas bacterianos 1-3. A maior parte destes protocolos contar com a inserção de plasmídeos replicativos condicionalmente (por exemplo, abrigando replicões pir-dependentes ou sensíveis à temperatura 1,2). Estes plasmídeos são integrados nos cromossomas bacterianos com base na homologia mediada por recombinação. Esses mutantes de inserção são muitas vezes usado diretamente em ambientes experimentais. Em alternativa, a selecção para a excisão do plasmídeo seguido por sua perda pode ser realizada, que para bactérias gram-negativas depende frequentemente da enzima sucrase contra-seleccionável de levana, codificada pelo gene sacB 4. A excisão pode restaurar o genótipo de pré-inserção, ou em resultado de uma troca entre o cromossoma e a cópia mediada por plasmídeos do gene modificado. Uma desvantagem desta técnica é que é demorado. O plasmídeo tem que ser clonado primeiro, que exige a transferência horizontal em V. cholerae (mais n otably por acasalamento com um E. coli estirpe dadora) ou transformação artificial deste último, e da excisão do plasmídeo é aleatório e pode restaurar o genótipo inicial ou criar a modificação desejada se nenhuma selecção positiva é exercida. A seguir, apresentamos um processo para a manipulação rápida da V. cholerae cromossoma (s) 5 (Figura 1). Este método TransFLP baseia-se na descoberta recentemente indução mediada por quitina de competência natural nesse organismo representativo 6 e outros do género, tais como Vibrio V. fischeri 7. Competência natural permite a captação de ADN livre, incluindo fragmentos de PCR gerados pelo DNA. Uma vez absorvido, o ADN recombina com o cromossoma, dada a presença de um mínimo de 250-500 pb da região flanqueadora homólogo 8. Incluindo um marcador de selecção de entre estas regiões flanqueadoras permite a fácil detecção de transformantes que ocorrem com frequência.
t "> Este método pode ser usado para diferentes manipulações genéticas de V. cholerae e potencialmente também outras bactérias naturalmente competentes. Fornecemos três exemplos novos do que pode ser conseguida por este método, além do nosso estudo publicado anteriormente em deleções de um único gene e do Além da afinidade tag-seqüências 5. passos de otimização Vários sobre o protocolo inicial de quitina induzida por transformação natural 6 são incorporados neste protocolo TransFLP. Estes incluem, entre outros, a substituição de fragmentos de conchas de caranguejos por disponível comercialmente quitina flocos 8, a doação de PCR locais derivado de ADN como a transformação de material 9, e a adição de sítios de recombinação FLP-alvo FRT () 5. DRF permitir a excisão sítio-dirigida do marcador de selecção mediada pela recombinase Flp 10.O método TransFLP descrito acima e noutros locais 5 tem sido extensivamente utilizada no nosso laboratório. O tipo de manipulações genéticas que são viáveis incluem, entre outros: a eliminação de genes individuais e aglomerados de genes, a deleção de ilhas genómicas (por exemplo, VPI-1), a inserção de sequências a montante de um gene de interesse (por exemplo, sequências do promotor) e da inserção sequências na extremidade de um gene específico (por exemplo,</em…
The authors have nothing to disclose.
Eu gostaria de agradecer Olga de Souza Silva para assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |