Summary
의 게놈을 수정하는 빠른 방법
Abstract
몇 가지 방법이 박테리아 염색체 1-3 조작 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 (예 : PIR에 따라 달라 나 온도에 민감한 replicons에게 1,2을 품고) 조건 replicative의 plasmids의 삽입에 의존하고 있습니다. 이러한 plasmids은 호몰 로지로 인한 재조합에 따라 세균 염색체에 통합되어 있습니다. 이러한 insertional 돌연변이는 종종 직접 실험 설정에 사용됩니다. 또는 손실에 이어 플라스미드 절단에 대한 선택은 종종 sacB 유전자 넷으로 인코딩 된 카운터 선택 레반의 sucrase 효소에 의존 그람 음성 박테리아있는 수행 할 수 있습니다. 절단 중 하나 미리 삽입 유전자형 또는 염색체와 수정 된 유전자의 플라스미드 인코딩 복사본 사이의 교류의 결과를 복원 할 수 있습니다. 이 기법의 단점은 시간이 많이 걸리는 점입니다. 플라스미드는 먼저 복제 할 수 있습니다, 그것은 V.으로 수평 이동이 필요합니다 cholerae (대부분 N otably E.와 결합하여 대장균의 기증 부담) 또는 후자의 인공 변환 및 플라스미드의 절단은 임의입니다하거나 초기 유전자형을 복원하거나 더 긍정적 인 선택이 가해되지 않을 경우 원하는 수정을 만들 수 있습니다. 여기, 우리는 V.의 빠른 조작하기위한 방법을 제시 cholerae의 염색체 (들) 5 (그림 1). 이 TransFLP 방법은 같은 V.으로 속 장염의 유기체 6 다른 대표의 자연 능력의 최근에 발견 된 키틴로 인한 유도를 기반으로 fischeri 7. 자연 능력은 PCR 생성 된 DNA 조각을 포함한 무료 DNA의 이해 할 수 있습니다. 일단 차지하고, DNA가 일치하는 지역 8 측면을 노릴의 250-500 BP의 최소의 존재 주어진 염색체와 recombines. 이러한 측면을 노릴 지역에서 중간 선택 마커를 포함하면 자주 발생 transformants을 쉽게 감지 할 수 있습니다.
t는 ">이 방법은 V. cholerae의 다른 유전자 조작에 사용되며 잠재적으로 다른 자연적 능력이 박테리아 할 수 있습니다. 우리는 이전에 다음 ID로 출판 단일 유전자 삭제에 대한 연구와에 추가이 방법에 의해 수행 될 수있는 세 개 소설 예제를 제공합니다 연관성 태그 시퀀스 5 추가가. 키틴 유발 자연 변화 6의 초기 프로토콜에 관한 몇 가지 최적화 단계는이 TransFLP 프로토콜에 통합되어 있습니다.이 다른 사람들 사이에 상업적으로 이용 가능한 키틴 조각 8, PCR의 기부에 의한 게 껍질 조각의 교체를 포함 자료 9, FLP - 재결합 대상 사이트 (FRT) 5의 추가를 변형 등의 파생 DNA. FRT 사이트는 Flp recombinase (10)에 의해 중재 선택 마커의 사이트 감독 절단 할 수 있습니다.Protocol
TransFLP 방법 (그림 1)은 세 가지 다른 방법으로 예시되어 있습니다 : I) V.의 독성의 determinants를 인코딩 두 개의 인접한 유전자의 삭제 cholerae (예를 들어, ΔctxAB), II) pathogenicity 섬 (예 : ΔVPI-1)의 제거 및 III) T7 RNA의 효소에 의존 발기인 시퀀스의 통합은 업스트림 유전자 수준의 관심, 이후 수의 각각의 변형을 배경으로 인공 표현 (예를 들어, T7-tfoX) (그림 2).
1. 키틴 플레이크의 작성
- 표준 1.5 ML 플라스틱 관 키틴 조각의 무게 50-80 밀리그램. 이것은 대량으로 준비 할 수 있습니다. 키틴 조각은 시그마 (cat. 번호 C9213)에서 상업적으로 이용할 수 있습니다.
- 관의 뚜껑이 열려 유지 그 조각을 압력솥.
- 압력솥이 냉각 된 후 즉시 뚜껑을 닫습니다.
- 스토어 autoclaved 키틴 조각상온에서.
2. 선택 사항 : V.의 인공 변환 Flp Recombinase 인코딩 플라스미드로 cholerae
- electrocompetent 준비 V. 표준 방법가 11를 사용하여 cholerae 세포. -80에서 관할 세포의 aliquots를 저장 ° C.
- electrocompetent에 플라스미드 PBR-flp 5 일반 미니 준비 1-2 μl를 추가 V. cholerae 세포와는 electroporation 큐벳 (0.2 cm 간격 폭)에 혼합물을 전송합니다.
- 1.6 KV에서 펄스을 적용합니다.
- 0.9 ML SOC 매체를 추가 부드럽게 표준 14 ML 튜브에 세포를 전송할 수 있습니다. 30에서 2.5-3 시간에 대한 비 이동 품다 ° C.
- 판 100 μl와 30 ° C 하룻밤 100 μg / ML 암피실린 및 배양을 포함하는 LB 플레이트에 300 μl.
- 미래 TransFLP 실험을위한 글리세롤 주식 등의 단일 클론과 상점을 정화.
3. Oligonucleotide 설계 및 중합 효소 연쇄 반응
- 최소 6 oligonucleotides는 관심의 DNA 영역 (들)뿐만 아니라 PCR에 의한 FRT-둘러싸인 항생제 카세트를 (그림 3) 증폭 할 필요가 있습니다. 또한 삽입 된 PCR 조각 이외의 oligonucleotides의 프라이밍 한 쌍을 포함하는 것이 좋습니다. 이 통합 및 FRT-둘러싸인 항생제 저항 카세트 (예 : 그림 3-5의 '확인해 업'과 '해봐 다운'프리 머으로 묘사)의 정확한 절단을 확인 할 수 있습니다.
- oligonucleotides # 2, # 3, # 4, # 5주의를 디자인합니다. 그들은 충분히 템플릿 DNA에 (예를 들면 ~ 28 BP) 단련 할 수 있어야합니다. 템플릿 DNA는 프리 머에 대한 게놈 DNA (gDNA) 등 pROD17 12 PBR-FRT 관 - FRT (본 연구) 프리 머에 대한 # 3와 # 4 (등 # 2와 # 5 FRT - 칸 FRT - 포함 플라스미드 DNA입니다 그림 3A).
- 수 # 5 프리 머에게 # 2 디자인을 각각 # 2 / # 3와 # 4 / # 5 사이의 5'-끝에서베이스 페어링 다양한 (그림 3A
- PCR의 1 라운드 3 개 독립 PCR 반응을 수행합니다. 첫번째 oligonucleotides # 1과 # 2의 도움을 유전자 / DNA 지역 수준의 관심 상류 지역을 증폭됩니다. PCR은 세포 내에서 상동 재조합을 허용하는 길이 최소 500 BP의 조각 될 것입니다. 짧은 조각 (~ 250 BP)은 충분한 팔 수 있지만 권장되지 않습니다.
- 병렬로 FRT-둘러싸인 항생제 카세트를 증폭 두 번째 PCR을 수행합니다. 예제는 여기에 제공을 위해 주로 aph (관 R)를 사용했습니다. 사용 oligonucleotides이 반응 (그림 3A)에 # 3와 # 4.
- Concomitantly, PCR (3 샘플)로부터 하류 DNA 지역을 증폭. PCR 조각은 길이가 적어도 500 BP해야합니다. 템플릿 및 oligonucleotides # 5와 # 6 (그림 3A)과 같은 gDNA로 PCR을 수행합니다.
- 세 PCR의 정화 후조각은 PCR의 2 차 라운드를 수행합니다. 템플릿으로 첫 라운드에서 얻은 세 조각 같은 혼합을 사용합니다. 증폭은 oligonucleotides # 1과 # 6 촉매 있습니다. 그 결과 PCR 조각 (그림 3B)는 자연 변화 실험 (그림 1)에서 DNA를 변형 역할을합니다.
4. 키틴 유발 자연 변화
- 성장 V. 30에서 풍부한 미디어에서 aerobically cholerae 세포 ° C는 약 0.5의 600 nm의에서 광학 밀도에 도달 할 때까지.
- 원심 분리하여 박테리아를 수확. DASW 2 권에있는 셀을 resuspending하기 전에 정의 인공 매체 (DASW 6)에 한 번 펠렛을 씻으십시오. 멸균 키틴 조각 (지점 1 아래에 설명)의 50-80 MG에 문화의 1 ML을 추가합니다. 문화 경우 세균 항구 플라스미드 PBR-flp (선택 사항 점 2), 추가 암피실린 (50 μg / ML). 운동없이 16-24 시간에 30 ° C에서 알을 품다.
- g 추가 (& A)전자, 2 차 라운드 PCR-파생 조각 (지점 3에서 설명) 200 것이다. 광범위하게 키틴 표면에서 박테리아를 분리하지 않고 조심스럽게 섞는다. 운동없이 24 시간을위한 30 ° C에서 알을 품다.
- ≥ 30 초에 광범위하게 소용돌이 문화입니다. 선택 LB 매체 플레이트 (여기에 제공된 예제에 대한 예를 kanamycin 또는 gentamicin 함유 LB 플레이트)에 100-300 μl를 벌리고. 박테리아가 다른 항생제 concomitantly 암피실린을 추가하여 PBR-flp 플라스미드을 가지고 있고, 경우에 두 번 선택 접시를 사용합니다. 16-24 시간에 30 ° C에서 번호판을 길러 나 식민지가 표시 될 때까지.
- 선택적 판에서 단일 transformants를 분리합니다. 이러한 transformants는 더블 크로스 오버 이벤트로 인해 PCR 조각하여 원본 염색체 궤적을 대체하고 있습니다. 항생제 카세트의 제거가 필요하지 않습니다 경우에 이러한 변종을 직접 추가 실험을 위해 사용될 수 있습니다.
5. Flp의 선택적 카세트의 제거 (들)- 재조합
- 자연 변형 분석 해본하지 않을 경우 지점이 아래에 설명 된대로 인공 PBR-flp 플라스미드를 사용하여 transformants을 변환 할 수 있습니다.
- 16-24 시간에 37 ° C에서 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에 박테리아를 성장. 옵션 : 40 2-3 시간에 대한 사이의 온도를 변경 ° C 플라스미드 PBR-flp에서 flp의 표현으로 높은 기온 5,10에 드 억압되어, 약 한 후 새로운 접시로 전송 세균. 부화 8 시간.
- 항생제 함유하고 항생제 무료 한천 플레이트에 병렬로 클론을 restreaking하여, 항생제 - 감도 (그림 1 kanamycin 여기를 시연)을 테스트합니다. 하나의 중요한 식민지를 분리합니다. 당신이 더 다른 삭제 / TransFLP를 사용하여 삽입과 변형을 수정하고자하는 경우 글리세롤 주식 등의 암피실린 방지 복제를 고정.
6. 플라스미드 경화
- 에어로빅 조건에서 하루 아침에 문화를 성장하고30의 ° C. 모든 항생제의 추가없이 다양한 매체를 사용하십시오.
- 선택 사항 : 신선한 항생제없는 미디어의 밤 문화 1:100을 diluting하여 3-6 시간에 신선한 문화를 성장.
- 판이나 연속으로 일반 LB 한천 플레이트 (들)에 문화의 희석 (들)과 30에서 배양 ° 8-16 시간에 대한 C (식민지을 볼 때까지).
- 항생제 함유하고 항생제 무료 한천 플레이트 (그림 1)에 병렬로 클론을 restreaking하여 클론 암피실린 감도를 테스트합니다. 글리세롤 주식 등의 암피실린에 민감한 부담을 멈춰 봐.
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Representative Results
세 가지 예 대표 결과는 6도 4에 표시됩니다. 첫 번째 접근 방식은 이웃 한 유전자에게 ctxA과 ctxB을 삭제하기위한. 이들은 V.의 주요 독성 계수를 인코딩 cholerae, 콜레라 독소. 위에서 설명한 3 그림에 따라 우리는 TransFLP 방법에 대한 oligonucleotides를 설계했습니다. 부모의 변형은 ctxAB의 원래 DNA의 궤적과 ctxAB에 대한 삭제 저항 카세트의 해제 최종 변형에서 FRT-둘러싸인 항생제 저항 카세트를 숨겨 중간 변종은 (그림 4)의 유전자형을 위해 테스트되었습니다. 선택의 방법은 전체 셀 PCR했다. 우리는 만 염색체 DNA에 변화 PCR 조각 (그림 3)에 단련하지 않는 프리 머를 사용했습니다. 이 우리가 염색체의 상동 지역 (F와 함께 PCR 조각의 특정 사이트 교환을 확인 할 수igure 4A). PCR 조각 (그림 4B) 크기를 결정하기 위해 표준 아가로 오스 겔 전기 영동으로 구분되었다. 이 전략은 스트레인 중간체를 확인하고 최종 스트레인 구조 (들)을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
두 번째 예를 들어, 전체 게놈 섬의 제거, 우리는 목표 13로 장염 pathogenicity에게 섬 1 (VPI-1) 선택했습니다. 위에서 설명한 표준 TransFLP 절차는이 경우 실패했습니다. 이 같은 대형 DNA 영역이 키틴 유발 천연 변환 9를 사용 유사한 크기의 DNA 영역으로 교환 할 수 있다는 이전 연구에서 알려졌다. 따라서 우리는 가상 해당 지역과--삭제하고 대신 짧은 변화 PCR 조각은 (<3.5 KB) 제한 요소가 될 수 사이의 크기 차이. 따라서 우리는 두 단계에 TransFLP 방법을 사용하기로 결정 : 우리가 처음 하나의 FR 앞에 aph 유전자 (관 R)을 통합VPI-1의 시작 (그림 5A에서 도시)에서 T 사이트입니다. 우리는 우리가 pathogenicity 섬 (그림 5A)의 끝에서 두 번째 FRT 사이트에서 다음 추가 항생제 저항 카세트 (GM R, gentamicin 저항을 부여)를 삽입 할 수 자연 변화의 두 번째 라운드를 수행했습니다. 각각의 이중 방지 변형은 플라스미드 PBR-flp하고 위에 설명 된대로 TransFLP 방법은 계속 된을 삽입 할 electroporated되었습니다. 게놈 DNA (그림 5B)를 정화의 PCR에 의해 확인으로 인한 변형은 전체 VPI-1을 부족했다.
세 번째 예를 들어 우리는 상류 유전자 수준의 관심, 우리의 경우에는 유전자가 자연 변화 tfoX 6의 주요 레귤레이터 인코딩 T7 RNA 중합 효소의 의존적 인 발기인 순서를 통합. 이것은 표준 프로토콜에서 약간의 수정과 함께 TransFLP 방법을 사용하여 수행되었습니다 우리는 T7 RNA 의존 P를 포함심판에 따라 romoter의 합의 순서. 14 oligonucleotides # 4 # 5에 overhangs 있습니다. 이 전략을 통해 T7 RNA 중합 효소의 의존적 인 발기인 순서는 항생제 저항 카세트는 (그림 6) excised 한 후에도 염색체에 보관되었습니다. 우리는 V.으로 구조를 통합 lacUV5 발기인 (Blokesch, 게시되지 않은)에 의해 구동 T7 RNA 중합 효소의 유전자를 비호하는 cholerae 스트레인 ADVCH - T7POL. tfoX의 T7 RNA 중합 효소에 의존 표현 즉, 구조의 기능에 대한 테스트하기 위해, 우리는 LB 매체에 천연 변환 assays를 수행. 부모의 부담은 풍부한 미디어 및 자연 유도 인자의 키틴 (그림 6)의 부재에 tfoX 스크립트의 부족으로 인해 이러한 조건 하에서 자연적으로 transformable하지 않습니다. 이 표현형은 T7 RNA 중합 효소의이 인위적으로 (그림 6, 레인 1, 2, respe IPTG에 의해 유도하거나하지 여부와 무관했다ctively). 그러나, 상류 능력 유전자 tfoX의 T7 RNA 중합 효소에 의존 발기인을 포함하는 TransFLP 생성 된 스트레인 ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT는, 풍부한 매체 (그림 6, 레인 3과 4)에 실제로 자연적으로 transformable했습니다 . LB 매체 15 유도없이 T7 RNA 중합 효소에 의존 발기인의 생산 T7 RNA 중합 효소의 이미 베꼈 tfoX의 lacUV5 발기인의 누출로 인해. 통합 T7 RNA 중합 효소에 의존 발기인 순서 (그림 6, 레인 3)의 기능을 확인이 시작 자연 능력과 변화. 이 표현형이 크게 인해 lacUV5 발기인, IPTG (그림 6, 차선 4) 유도 인자의 추가로 T7 RNA 중합 효소의 가득 유도에 의해 향상되었습니다.
1 그림.TransFLP 방법의 흐름 차트입니다. 이 프로토콜에 설명 된 여섯 가지 사항이 초안을 작성한됩니다.. 1) 키틴 조각의 작성 2) 선택 사항 : V.의 인공 변환 Flp recombinase 인코딩 플라스미드와 cholerae,. 3) Oligonucleotide 설계 및 중합 효소 연쇄 반응,. 4) 키틴 유발 자연 변화, 5) flp - 재조합에 의해 선택 카세트 (들)의 제거,... 6) 플라스미드 경화 여기를 클릭하십시오 더 큰 그림을 볼 수 있습니다 .
그림 2. TransFLP 방법 세 가지 응용 가능성 개략도. Δ로 표시로 I) 콜레라 독소 유전자 인코딩 ctxA과 ctxB를 포함하는 1,458 BP의 DNA 조각은, 삭제되었습니다. II) ~ 40킬로바이트 장염 pathogenicity 섬 1 (VPI-1 13)야생 형 변형에서 삭제되었습니다. III) T7 RNA 중합 효소의 의존적 인 발기인 시퀀스 (28 BP)은 tfoX 유전자의 상류 통합되었습니다. 빨간색 사각형은 단일 FRT 사이트 (10)의 짧은 염기 순서 뒤에 왼쪽을 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. ctxAB의 삭제에 따라 프라이머 설계 및 PCR의 성능에 대한 설명. 패널 A : 템플릿으로 제공 각각 PCR의 게놈의 DNA (gDNA)와 plasmids pROD17 12 PBR-FRT - 칸 FRT,의 1 라운드하십시오. 필요한 oligonucleotides은 # 1 # 6입니다. 프라이머 # 2 / # 3와 # 4 / # 5 (삽입의 예) 또한 5'ends에서 서로 상당한 중복을 가지고해야합니다. 패널 B :의 2 차 라운드 후템플릿으로, 긴 조각이 프라이머 쌍 # 1 + # 6을 사용하여 얻을 수 있어야 1 라운드 PCR 조각을 기반으로 PCR은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 예상 결과가 ctxAB 삭제 전략 예시. 원래의 응력 (야생 형), insertional 돌연변이 Δ ctxAB :: FRT - 칸 FRT, 최종 변형 Δ ctxAB :: FRT들은 genotypes을 위해 테스트되었습니다. 패널 A : 특히 항생제 카세트의 절단과 관련하여 CTX-해봐 다운 프라이머 쌍의 CTX-해봐 업하고,의 차별화 전력의 개략도. 패널 B : 전체 세균 세포는 PCR 반응의 템플릿으로 사용되었습니다. 변경된 DNA를 확인하려면 궤적 프리 머 확인해 업 및 해봐 다운이 활용되었다. 증폭 PCR 조각은 아가로 오스 겔 전기 영동으로 분리되어 얼룩 SYBR 안전 DNA를 사용하여 시각화했다. 레인 1 : 와일드 타입 V. cholerae 변형, 차선 2 : 변형 Δ ctxAB :: FRT - 칸 FRT, 레인 3 : Δ ctxAB :: FRT. 예상 PCR 조각 크기는 패널에 따라이 오른쪽에 표시됩니다. L, 1킬로바이트 사다리 (Invitrogen)가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 게놈 섬의 삭제를 확인하는 전략. 패널 A : 장염 pathogenicity 섬 1 (VPI-1) (자유롭게 참조에서 적응 16,되지 규모에.)의 제도. 야생 형 변형에 대한 관심 지역은 표준 PCR 및 VPI-1 특정 프리 머 확인해 업 및 해봐 다운 (~ 40 KB)에 의해 비 amplifiable입니다. 따라서 추가oligonucleotide는 지역 내에서 어닐링까지 - 삭제 VPI-해봐 업과 함께 (VC0817 - 뒷면) 적용되었습니다. 패널 B : 대표 결과 템플릿 및 프라이머 쌍으로 각각의 변종의 게놈 DNA를 사용하여 각 이미지 위에 지적했다. 긴장은 시험 : 야생 형 V. cholerae 변형 (레인 1), 스트레인 VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (차선 2), 그리고 ΔVPI-1 :: FRT (레인 3). 로 패널에서 예측 PCR 조각의 크기는이 오른쪽에 표시됩니다. L, 1킬로바이트 사다리 (Invitrogen)가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
6 그림. 대표 표현형을 인공 프로모터 시퀀스의 삽입 후. T7 RNA 중합 효소의 의존적 인 발기인 순서는 TransFLP metho를 사용하여 능력을 규제 유전자 tfoX의 상류 통합되었습니다D (그래프 위의 스케치). 부모 V. cholerae 응력 (ADVCH-T7POL)는 lacUV5 발기인에 의한 T7 RNA 중합 효소의 유전자가 포함되어 있습니다. 그래프 : 부모의 변형 ADVCH-T7POL (레인 1, 2)와 TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT, 레인 3 및 4)에 의해 조작 변형이 (레인 1과 3이없는 상태에서 자연 transformability에 대한 테스트되었습니다 ) 또는 1mM IPTG (레인 2, 4)의 존재. 변형 게놈 DNA가 변형 A1552-LacZ 관 8에서 파생되었다. 변환 주파수는 Y-축에 부여됩니다. <DL, ~ 5 × 10 -8의 검출 한도 이하로. ** P <0.01 (로 로그인을 변환 데이터 학생의 t 시험에 의해 결정). 텍스트 'T7'과 검은 색 화살표 :. T7 RNA 중합 효소에 의존 발기인 시퀀스는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
TransFLP 방법은 5 광범위하게 저희 연구실에서 사용 된 이상, 다른 곳에서 설명했다. 가능한 아르 유전자 조작의 종류는 다른 이들과 같습니다 : 하나의 유전자 및 유전자 클러스터의 삭제, 게놈 섬의 삭제 (예 : VPI-1) 관심 유전자 (예를 들어, 발기인 시퀀스)의 상류 시퀀스의 삽입과 삽입을 특정 유전자 (예를 들어, 인코딩 연관성 태그)의 끝 부분에 시퀀스.
TransFLP에 대한 수입 전제 조건은 각각의 V.입니다 cholerae 변형은 자연스럽게 transformable 있습니다. 이 기능은 특히 콜레라 환자에서 파생 분리에, 때로는 그렇지 않습니다. 이러한 긴장은 자주 정족수 감지, HapR 17의 주요 레귤레이터를 인코딩 유전자 내에서 정족수 감지 회로 예에서 변이되어 있습니다. hapR의 복사본을 다시 제공하는 것은 exempli 이러한 변종 6 자연 transformability을 복원HapR - 결함이있는 변형 N16961 18 fied.
가능한 수정은 이러한 자연의 변화 팔 경우에는 주파수가 너무 낮습니다 후 박테리아의 강화로 통합 할 수 있습니다. 키틴 유도 천연 변환 분석을하는 동안 PBR-flp 플라스미드가 이미 존재하는 경우에 변환 주파수가 일반적으로 낮은 수 있다는 점에 유의하십시오. 이것은 가능성이 가장 높은 항생제 저항 카세트 이러한 transformants에 대한 선택 수 없다는의 조기 절단 될 것 PBR-flp에서 flp 유전자의 온도에 민감한 표현의 일부 누설로 인해 발생합니다. 따라서 우리는 자연 변환 단계 후에 PBR-flp 플라스미드를 삽입하는 데 중요한 경우에 권장합니다.
또 다른 중요한 단계는 세 1 회전 PCR 조각을 결합 할 PCR의 제 2 라운드입니다. 이 부분 조각이 PCR 정말이에요 후 나타날 수있는가 발생할 수 있습니다ction (예 : 만 조각의 일부 어셈블리 '최대'와 'FRT - 칸 FRT'도 1에 따라). 이 무시할이며, 대상 염색체 영역과 같은 2 상동 재조합이 상황에서 발생할 수 없습니다. 항생제 저항 카세트를 숨겨 만 transformants가에 대한 선택으로, 비 원하는 DNA 교환이있는 다른 모든 transformants은 제외됩니다.
염두에 두어야 할 또 다른 점은 여러 발을위한 절차의 반복에 대해입니다. 우리는 이미 성공적으로 pathogenicity 섬 (VPI-1)와 다른 독성 유전자 클러스터 (Blokesch, 게시되지 않은)의 삭제와 ctxAB 유전자 클러스터의 삭제를 결합했습니다. 또한, 우리는 효과적으로 이러한 변종 (상류 tfoX와 다른 곳)에서 T7 RNA 중합 효소에 의존 발기인을 통합하였습니다. 그러나, 구상 유전자형은 지속적으로 D와 같은 식민지 PCR에 의해 (예를 들어, 모든 스트레인 중간체에 대한 검사를해야합니다) 그림 4에서 emonstrated. 이 PBR-flp 플라스미드는 여전히 박테리아에 존재하는 동안 서로 FRT 상처 뒤에 왼쪽의 원치 않는 Flp로 인한 재조합 (모든 수치에서 빨간색 사각형으로 표시)을 제외하는 데 도움이됩니다. 이것은 아마 먼에 위치한 유전자에 대한 무시의 사이 지역의 절단이 필수적인 유전자의 삭제로 인해 치명적인 것이라고 확률로 매우 높습니다 할 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 operons 내에서 유전자의 삭제를 논의하고 싶습니다. 우리는 뒤에 FRT 상처를 떠나는 상류 유전자의 삭제가 하류 유전자 (들)의 표현을 변경할 수 있다는 제외 할 수 없습니다. 이 효과는 관찰 할 수있는 표현형의 원인이되지 않는, 그러나 이것은 실제로 삭제로 인한되어 있는지 확인하려면, complementation 분석을 권장합니다. 우리가 이미 성공적으로 실험실에서 사용되는 한 또 다른 컨트롤은 유전자 수준의 관심 withou의 FRT 상처 하류의 통합이다t는 후자를 삭제. 우리는 아직 우리의 실험실에서 이러한 문제를 관찰 할 것이 아니라 자신의 존재를 제외 할 수 없습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
나는 기술 지원을 위해 올가 드 수자 실바을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (SNSF) 부여 31003A_127029에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
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