一个快速的方法来修改的基因组<em> V.霍乱</em>进行说明。这些修改包括删除单个基因,基因簇和基因组岛屿以及集成的短序列(如启动子元件或亲和标签序列)。该方法是基于对自然的改造和FLP重组。
有几种方法可用来操纵细菌染色体1-3。这些协议大多依靠的条件复制型质粒插入( 例如 PIR依赖或对温度敏感的复制窝藏1,2)。这些质粒基于同源性的介导的重组整合到细菌染色体中。这样的插入突变体往往直接用于实验的设置。可替换地,可以进行选择质粒切除后跟其损失为革兰氏阴性菌,往往依赖于计数器可选择的果聚糖蔗糖酶的酶编码的sacB基因的 4。的切除可以恢复的插入前的基因型或在经修饰的基因的染色体和质粒编码的副本之间的交换的结果。这种技术的一个缺点是,它是耗时的。首先被克隆的质粒,它需要五的水平转移到霍乱 (最多n个 otably通过交配与E.大肠杆菌供体菌株)或人工转变后者;和切除该质粒是随机的,可以恢复初始的基因型或创建所需的修改,如果没有施加正选择的。在这里,我们提出了一个方法,为快速操作的五霍乱弧菌染色体()5( 图1)。此TransFLP方法是基于最近发现的几丁质的自然能力介导的诱导在此有机体6和其他五,如弧菌属代表鲵 7。自然能力允许的游离DNA的摄取,包括PCR产生的DNA片段。一旦占用,存在一个最小的250-500的bp的侧翼同源区域8给出的染色体DNA的重组。包括选择标记这些侧翼区之间可以方便地检测经常发生转化的。
的TransFLP上述方法和其他地方已被广泛使用在我们的实验室。种遗传操作是可行的,包括其中包括:删除单个基因和基因簇的基因岛( 例如 ,VPI-1),缺失,插入感兴趣的基因的上游侧( 例如 ,启动子序列)的序列,并插入序列结束时的一个特定的基因( 例如 ,编码的亲和标签)。
一个导入的先决条件TransFLP是,各自的五霍乱菌株是自然变形。?…
The authors have nothing to disclose.
我要感谢奥尔加·德索萨·席尔瓦的技术援助。这项工作是由瑞士国家科学基金会(SNSF)31003A_127029格兰特的支持。