שיטה מהירה כדי לשנות את הגנום של<em> V. cholerae</em> הוא תאר. שינויים אלה כוללים מחיקה של גנים בודדים, אשכולות גנים ואיים הגנומי כמו גם האינטגרציה של רצפים קצרים (למשל אלמנטים של פרומוטר או רצפי זיקת תג). השיטה מבוססת על השינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה.
מספר שיטות זמינות כדי לתפעל כרומוזומים חיידקים 1-3. רוב הפרוטוקולים הללו מסתמכים על ההחדרה של פלסמידים replicative מותנה (למשל חסת replicons תלוי-PIR או רגיש לטמפרטורת 1,2). פלסמידים אלה משולבים לתוך הכרומוזומים חיידקים המבוססים על רקומבינציה הומולוגיה בתיווך. מוטנטים insertional כאלה לעתים קרובות להשתמש ישירות בהגדרות ניסיוניות. לחלופין, בחירה לכריתת פלסמיד ואחרי ההפסד שלה ניתן לבצע, אשר לחיידקים גראם שליליים, לעתים קרובות מסתמכת על אנזים sucrase נגד בחירת levan מקודד על ידי גן sacB 4. הכריתה יכולה לשחזר את הגנוטיפ טרום כניסה או תוצאה בחילופים בין כרומוזום והעתק פלסמיד המקודד של הגן השונה. חסרון בשיטה זו הוא שזה זמן רב. פלסמיד יש המשובט ראשון, זה דורש העברה אופקית לV. cholerae (ביותר n otably ידי הזדווגות עם E. זן חיידק תורם) או שינוי מלאכותי של האחרון, והכריתה של פלסמיד הוא אקראי וגם תוכל לשחזר את הגנוטיפ הראשוני או ליצור שינוי הרצוי, אם אין ברירה חיובית הוא הפעיל. כאן, אנו מציגים שיטה למניפולציה מהירה של V. כרומוזום cholerae (הים) 5 (איור 1). שיטת TransFLP זה מבוסס על האינדוקציה גילתה לאחרונה כיטין בתיווך של כישורים טבעיים באורגניזם 6 והשני נציג זה של Vibrio הסוג כמו V. 7 fischeri. יכולת הטבעית מאפשרת את הספיגה של דנ"א בחינם כולל שברי DNA PCR שנוצר. ברגע שמתחיל לעלות ומשלב מחדש את ה-DNA בכרומוזום נתון הנוכחות מינימאלית של 250-500 נקודתי בסיס של איגוף האזור 8 הומולוגיים. כולל סמן בחירה שבין אזורי איגוף אלה מאפשר זיהוי קל של transformants לעתים קרובות המתרחש.
t "> שיטה זו יכולה לשמש למניפולציות גנטיות שונות של V. cholerae וחיידקים באופן טבעי מוסמכים פוטנציאלי גם אחרים. אנו מספקים שלוש דוגמאות רומן על מה שניתן להשיג בשיטה זו בנוסף למחקר שלנו שפורסם בעבר על מחיקות גן יחידות ו תוספת של רצפי זיקת תג 5. צעדי ייעול כמה נוגעים לפרוטוקול הראשוני של שינוי כיטין המושרה טבעי 6 תשולבנה בפרוטוקול TransFLP זה. אלה כוללים בין השאיר את ההחלפה של רסיסי פגז סרטנים ידי כיטין פתיתים זמינות מסחרי 8, התרומה של ה-PCR דנ"א המופק כהפיכת חומר 9, ותוספת של אתרי יעד FLP-רקומבינציה (FRT) 5. אתרי FRT לאפשר כריתת אתר ביים של סמן הבחירה מתווך על ידי FLP recombinase 10.שיטת TransFLP שתוארה לעיל ובמקומות אחרים 5 כבר נעשה שימוש נרחב במעבדה שלנו. הסוג של מניפולציות גנטיות שישימות כולל בין שאר: מחיקה של גנים בודדים ואשכולות גנים, מחיקה של איים גנומיים (למשל, VPI-1), החדרה של רצפים במעלה זרם של גן של עניין (למשל, רצפי פרומוטר) והחד?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוני להודות אולגה דה סוזה סילבה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע שויצרי (SNSF) גרנט 31003A_127029.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |