Summary
某些鼠标菌株能够抵抗与髓鞘碱性蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。这里描述的是一个简单的免疫协议，扭转反应迟钝和麻痹性疾病引起几个典型的EAE的耐鼠标污渍。
Abstract
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种中枢神经系统（CNS）炎症性疾病，并已作为研究人类脱髓鞘疾病，多发性硬化症（MS）的动物模型。脑脊髓炎的特点是进入中枢神经系统的病理单核细胞浸润和麻痹性疾病的临床表现。类似于MS，EAE的是在某些小鼠品系遗传控制下也很容易受到疾病的诱导，而其他有抗药性。通常情况下，免疫C57BL / 6小鼠（H-B）与髓鞘碱性蛋白（MBP）的失败发展麻痹的迹象。此反应迟钝是肯定不会由于抗原加工缺陷或抗原的MBP介绍，这里描述的一个实验性协议已用于诱导C57BL / 6小鼠以及其他知名的抗小鼠品系严重脑脊髓炎。此外，脑炎C57BL / 6和BALB / c小鼠，以MBP的反应性T细胞克隆成功完全孤立和传播。
实验协议涉及使用蜂窝收养传输系统的MBP-底漆（200微克/鼠标）C57BL / 6捐助淋巴结细胞分离和培养五天与扩大池的MBP-特异性T细胞的抗原。在文化时期的结束，50万个活细胞通过尾静脉转移到天真同源收件人。通常这样对待的受体小鼠不发展脑脊髓炎，从而重申了他们的耐药现状，他们可以无限期地保持正常。十天后细胞移植受体小鼠挑战与完全弗氏佐剂（CFA）乳化四个网站在侧翼的MBP。严重的EAE的开始发展，在这些小鼠十至十四天后的挑战。结果表明，诱导疾病的抗原具体作为与不相干抗原挑战没有引起疾病的临床症状。值得注意的是，抗原剂量滴定挑战受体小鼠表明，它可能是为5微克/鼠标。此外，抗原挑战的时机动力学研究表明，早在5天抗原的挑战，如超过445天的抗原挑战，诱发疾病的挑战是有效的。这些数据有力地指向保持反应迟钝“长寿”的T细胞人口的参与。在这个系统中的调节性T细胞（Treg细胞）的参与，没有被定义。
Protocol
1。准备终审法院乳化的抗原
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）的2毫克/毫升的浓度，溶解豚鼠MBP（根据的方法Swanborg1的准备，并在冻干的形式储存在4°C）。如果合成的MBP肽（MBP的60-80 SHHAARTTHYGSLPQKSQR）2，准备2毫克/毫升的解决方案。达成鲁尔乐的玻璃注射器吸取适量抗原溶液（0.1毫升每鼠标进行免疫接种）。
- 画了一个完全弗氏佐剂H37Ra株（0.1wt％的）（终审法院，Difco公司实验室）等于另一个玻璃注射器到鲁尔乐配备的抗原溶液的体积。
- 连接一个三通阀的两个玻璃注射器。混合来回推动活塞与终审法院的MBP的解决方案。保持运动，直到形成乳状液。
- 如果要测试形成乳状液，推到一个注射器的混合物。断开空的注射器，拉ţ他柱塞后退了几步，排出残留的乳液在室温下的清洁水的烧杯下降。如果乳化降保持完好的水面上，形成乳状液。如果分散乳化降，重新连接注射器和继续搅拌议案。
- 使用1毫升的塑料注射器的免疫程序，以确保提供一个准确的抗原剂量。转移抗原乳剂的塑料注射器，拉出柱塞和开放三通阀1.4断开以前的玻璃注射器插入空塑料注射器。
- 填补了塑料注射器，玻璃注射器的柱塞推到边缘。插入背面的塑料注射器的柱塞和向后推，直到达到1.2毫升标记的塑料注射器多余的乳液。这个动作可确保无气泡的塑料注射器内被困。
- 从三通阀中取出的塑料注射器。阿塔CH＃26号针头的塑料注射器。推柱塞让乳液填充空隙体积的针1毫升标记。
2。供体小鼠的免疫
注：通常是雌性C57BL / 6小鼠注射抗原乳液在四个网站在侧翼，麦克法林的3组，在国家卫生研究院原先设计的方法。对于一个有经验的研究者，一个人就可以完成整个任务。对于初学者来说，帮助可征求这样一个人持有鼠标和其他人注射。另外，鼠标就可以注射麻醉。
- 牢牢按住鼠标，颈部皮肤和尾巴之间的第 4和第 5 次手指，胸部和腹部等方便忍住。
- 1毫升的塑料注射器针头放置在略高于右腋下胸部网站（莫使用）和0.05毫升抗原乳化皮下注入。可以看出，通过面色苍白，皮肤稍隆起的白色终审法院。重复相同的网站在略高于左腋下胸部。
- 松开尾巴，并采取举行的右脚（鼠标），打开它，并保持它之间的第 4和第 5 次手指。定位略低于肋骨的情况下，在右侧的网站，并注入抗原乳剂0.05毫升。
- 松开右脚，转其他方式和鼠标之间的第 4和第 5 次手指按住左脚（鼠标）。找到下面的肋骨的情况下只是在左翼的网站，并注入抗原乳剂0.05毫升。
- 改变到一个新的针头，注射后10只小鼠，或是否变得迟钝针。
3。接种后7至10天组织文化的淋巴结细胞的分离
- 接种后7至10天，牺牲老鼠清除淋巴结。安乐死的首选方法是通过CO 2吸入。牺牲后，在夹层板打下鼠标与四肢伸出，并与针板固定在它的后面。小鼠70％的乙醇喷雾润湿。
- 纵向切缝在皮肤中的下巴，用无菌剪刀和镊子腹部的下端中间。
- 从腹股沟区切下来每条腿腹部皮肤。剥离背部和牵制的皮肤，暴露腹股沟淋巴结肿大。
- 削减的皮肤，使皮肤可以去皮背部和牵制暴露腋窝淋巴结附近的腋下沿前肢（左，右）。
- 两个双钳共同努力，拉远覆盖的结缔组织和周围的腹股沟淋巴结。当结缔组织清除，放置一对钳下的淋巴结和拉远离身体。放置淋巴结在35毫米培养皿用无菌PBS填充。
- 拉远覆盖两个腋窝淋巴结肿大，使用两对镊子的结缔组织。孤立淋巴结和放置在培养皿中。必须非常小心，不要打破过路的面积出血使得很难确定淋巴结的血管。
- 所有的淋巴结收集后，将培养皿生物安全罩。打破和挑逗的淋巴结除了两对钳子，研磨反对。此外，淋巴结，可以打破柱塞3毫升的塑料注射器对培养皿底部的淋巴结按使用平头。
- 通过一个尼龙网戏弄淋巴结细胞悬液去除膜和杂物。
- 弥补的淋巴结细胞悬液50毫升，用无菌PBS。在1000 rpm离心10分钟。培养液中悬浮颗粒。做一个可行的çELL计数，调整浓度4×10 6细胞/ ml。辅以10％小牛血清，2毫米L-谷氨酰胺，1毫米的MEM丙酮酸钠，0.1毫米的MEM非必需氨基酸，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，10毫米的HEPES缓冲和5×UseRPMI 1640 10 -5 m 2-ME公司。预温的文化之前，重新悬浮细胞。
- 培养的细胞于24孔培养板，每孔2 mL体积（最终细胞浓度为8×10 6细胞/孔）。在终浓度为100微克/毫升，每孔加入抗原。放置在37℃培养箱培养板，用5％的CO 2。孵育5天的细胞。
4。收获后5天启动文化培养淋巴结细胞
- 在每口井的细胞混合巴斯德玻璃吸管或小的体积移液器吸取了上下。收获细胞，以50 mL离心管中。
- 10分钟1000转离心细胞。 resus挂起细胞沉淀成小体积的PBS。
- 计数细胞，调整可行的细胞浓度为2.5×10 8细胞/毫升无菌PBS。到装有26号针头注射器吸取细胞。
- 在受体小鼠的笼子里，以帮助扩张尾静脉放置热灯。
- 使用鼠标持有人的持有人通过的缝隙，延长鼠标的尾部。拉扩大尾巴。找到静脉。
- 注入细胞悬液0.2毫升/鼠标，相当于5×10 7细胞。
5。受体小鼠的抗原挑战20天细胞转移和疾病症状的发展
- 挑战受体小鼠抗原与疾病的征兆。作为“供体小鼠免疫”第2相同的程序。
- 观察发展麻痹病抗原的挑战后，7至10天。
- 疾病开始在尾部的弱点。疾病被评定为1当尾巴变得松弛。当鼠标在一个后肢瘫痪的疾病被评定为2。疾病等级为3时，两后肢瘫痪和鼠标拖动两个后肢向前爬行。疾病等级为4时，鼠标失去使用两个前肢，使鼠标完全动弹不得。疾病等级为5时，鼠标是奄奄一息，身体蜷缩起来。死亡，疾病年级6 4拿下。
- MBP特定脑脊髓炎诱导C57BL / 6小鼠后，此协议是单相。小鼠可能从疾病中恢复过来，但不进行自发的复发。
6。代表结果
老鼠收到引物，并在体外扩大捐助淋巴结细胞的发展并不EAE的疾病症状，反映他们的抵抗疾病的感应。然而，严重的疾病后抗原的挑战（ 见表一 ），表明抗原挑战的能力逆转耐药机制。抗原挑战，指出两个特殊功能的抗原剂量和挑战，诱发疾病的动力学。需要非常低剂量的抗原，如表三所示。令人惊讶的是，小鼠获得供体细胞较上年同期仍可能发展为严重疾病与挑战抗原（ 表四 ）。这两种意见强烈建议“长寿”的T细胞的参与，在维护EAE的阻力。该协议是适用于许多EAE的抗小鼠品系。
图1。在著名的抗小鼠品系对EAE诱导的实验设计流程图。
| 临床脑脊髓炎 继转移后 | |||||||
| 应变 | 抗原 | 发生率 | AV。病级 （范围） | AV。发病日 （范围） | 发生率 | AV。病级 （范围） | AV。发病日 （范围） |
| SJL | MBP的 | 21/21 | 4.0（3-5） | 8.0（6-10） | ND折价 | ND折价 | ND折价 |
| C57BL / 6小鼠 | MBP的 | 0/10 | - | - | 7/7 | 3.85（3-5） | 9.28（9-10） |
| BALB / C | MBP的 | 0/7 | - | - | 5/5 | 3.2（3-4） | 7.0（7） |
| C3H/HeJ小鼠 MBP的 | 0/7 | - | - | 4/4 | 3.2（3-4） | 8.0（8） | |
| C57BL / 6小鼠 | MBP的60-80 | 0/4 | - | - | 4/4 | 2.75（2-4） | 10.2（9-11） |
表一，在C57BL / 6小鼠的MBP-介导的EAE的诱导。在C57BL / 6小鼠EAE的引物和体外扩大供体细胞中没有引起过继转移。抗原的挑战后细胞转移呈现易患疾病诱导小鼠。 AV。，平均。钕，没有这样做。
| 抗原的挑战后的临床脑脊髓炎 | ||||
| 吸抗原 | 挑战抗原 | 发生率 | AV。病级 （范围） | AV。发病日 （范围） |
| MBP-终审法院 | 终审法院仅 | 0/3 | - | - |
| MBP-终审法院 | 卵，终审法院 | 0/3 | - | - |
| MBP-终审法院 | MBP-终审法院 | 3/3 | 4.0（4.0） | 7.7（7-9） |
表二。特异性抗原的挑战。收件人小鼠吸抗原以及其他无关抗原的挑战，。只吸抗原诱发严重的疾病。卵：鸡卵清蛋白。 AV。，平均。
| 抗原的挑战后的临床脑脊髓炎 | |||
| 挑战抗原剂量（微克/鼠标） | 发生率 | AV。病级 （范围） | AV。发病日 （范围） |
| 200 | 4/4 | 3.75（3-4） | 8.25（7-9） |
| 100 | 4/4 | 3.67（3-4） | 7.5（7-8） |
| 50 | 4/4 | 3.25（3-4） | 8.25（7-10） |
| 25 | 4/4 | 3.0（3.0） | 8.25（8-9） |
| 10 | 4/4 | 3.0（3.0） | 8.76（8-9） |
| 5 | 4/4 | 2.5（2-3） | 9.75（9-10） |
| 1 | 2/4 | 1.0（1.0） | |
| 0 | 0/4 | - | - |
表三。挑战抗原剂量需要诱导疾病。用于各种挑战受体小鼠的MBP浓度进行了测试。 AV。，平均。
| 抗原的挑战后的临床脑脊髓炎 | ||||
| 挑战抗原 | 天的挑战 | 发生率 | AV。病级 （范围） | AV。发病日 （范围） |
| MBP-终审法院 | 5 | 3/4 | 1.33（1-2） | 9.67（9-10） |
| MBP-终审法院 | 10 4/4 | 3.0（3.0） | 8.25（7-9） | |
| MBP-终审法院 | 15 | 4/4 | 3.75（3-4） | 7.25（7-8） |
| MBP-终审法院 | 25 | 4/4 | 4.0（4.0） | 8.0（7-9） |
| MBP-终审法院 | 35 | 4/4 | 3.5（3-4） | 7.5（7-8） |
| MBP-终审法院 | 60 | 4/4 | 3.75（3-4） | 9.0（8-10） |
| -------------------------- | ||||
| MBP-终审法院 | 343 | 3/3 | 3.0（3.0） | 10.33（10-11） |
| MBP-终审法院 | 445 | 3/3 | 3.0（3.0） | 7.0（7.0） |
表四。动力学抗原挑战。受体小鼠在不同的时间点后的挑战采取IVE细胞转移。 AV。，平均。
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Discussion
在小鼠EAE的研究往往利用的neuroantigens，髓鞘碱性蛋白（MBP），蛋白脂蛋白（PLP）有或髓鞘少突胶质细胞蛋白（MOG）。早先的研究中大多采用的MBP。工党刺激SJL小鼠的强烈和一致的反应。最近，MOG是共同neuroantigen使用，因为很容易受到疾病与此抗原诱导B6小鼠。许多有针对性的小鼠品系的基因B6的遗传背景。有趣的是，B6小鼠容易与MOG诱导EAE，但抵抗疾病的MBP诱导。
许多以前的努力阐明对EAE疾病的诱导机制，影响生产的细胞因子介导的恢复和调节性T细胞5-7为中心的机制。名震EAE的抗小鼠如何可以颠覆另一方面，疾病的诱导，没有得到广泛的调查。这可能是由于难以量化ünresponsiveness。在1981年8嫩首先表明B6小鼠与环磷酰胺治疗，使这些老鼠易感到EAE的MBP诱导。其他表明，反γ干扰素治疗，还成功地诱导B6和BALB / c小鼠9,10疾病。应当指出，所有这些研究针对非抗原特异性标志物。另一方面，这里所描述的协议侧重于不同方面的EAE的阻力。这里只特异性抗原挑战可以克服EAE的反应迟钝，使疾病的诱导。该协议包括引捐赠者的T细胞过继转移和敏感阶段（见表一）与抗原的挑战与EAE的阻力阶段。可以设计实验研究的内在因素，保持EAE的阻力，以及扭转这种反应迟钝的因素。最初，它表明，抗脑脊髓炎小鼠免疫时，能装载自身免疫反应MBP的4。后来，它被证明在这些小鼠2，脑炎T细胞的存在。一些11,12最近的研究表明，B10.S小鼠抗CD25抗体治疗前的小鼠的免疫蛋白脂蛋白（PLP）有转换从抗小鼠易感，暗示调节性T细胞（Treg细胞）的作用保持EAE的阻力。然而，这并不是C57BL / 6小鼠同样的待遇和免疫的MBP 13时。大部分的老鼠仍然反应迟钝。因此，EAE的阻力可能是多因素。据推测，案件的C57BL / 6小鼠响应到MBP的胸腺选择删除最MBP反应性T细胞等，在外围的MBP反应性T细胞的频率非常低。这低于门槛低频率会呈现无法回应与MBP的免疫小鼠。的挑战，剂量，通过未知的机制，是能够克服的频率问题和m指望。2-15自体免疫反应。进一步调查的可能机制将包括在抗原挑战脑炎易感性的影响抑制调节性T细胞IL-6月12日的作用。
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Disclosures
没有财务披露。
Acknowledgments
从国立卫生研究院的资助（以R01 NS37253和N01，NS055167）和国家多发性硬化症协会（的RG 3288 - A6）在部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guinea pig spinal cords |  Rockland Immunochemicals |
GP-T065 | frozen |
| Freund’s Adjuvant, complete H37Ra | Difco Laboratories | 231131 | |
| Multifit interchange-able syringe | BD Biosciences |
512133 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. |
10-040-CM | |
| OVA | Sigma-Aldrich |
A5503 | |
| Mice | Jackson Laboratory | B6 mice: 0000664 | Bar Harbor, Maine |
References
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