תרבות explant עור אגרוף ביופסיה לגזירה של fibroblasts אדם היסודי

Summary

פרוטוקול תרבות explant פיברובלסטים מביופסיות אגרוף עור אנושי הוא דרך פשוטה וחזקה מבחינה טכנית להפיק תאי עור בתוך 4-8 שבועות לבנקאות של כ 15-20 מיליון תאים במספר מעבר נמוך.

Abstract

רקמות ושורות תאים שמקורם אדם עם מחלה הן מקורות אידיאליים ללמוד פנוטיפים סלולריים הקשורות למחלה. fibroblasts מטופל שמקורם בפרוטוקול זה היה בשימוש בהצלחה בנטילה של תאי גזע pluripotent מושרה למחלת מודל ^1. קטעים ראשונים של fibroblasts אלה יכולים לשמש גם עבור מבחני תפקודיים מבוססי תאים ללמוד מסלולים ספציפיים, מנגנוני מחלה ² ולאחר מכן סמים גישות הקרנה. היתרון של הפרוטוקול שהוצג על הליכים אנזימטיות הוא 1) שחזור של הטכניקה מכמויות קטנות של רקמות הנגזרות מחולים מבוגרים, חולים כגון החולים במחלת פרקינסון, 2) גישה טכנית הפשוט על מתודולוגיות מאתגרות יותר באמצעות טיפולים אנזימטיות, ו3 ) שיקול הזמן: פרוטוקול זה לוקח 15-20 דקות ויכול להתבצע מייד לאחר הגעתו ביופסיה. טיפולים האנזימטית יכולים לקחת עד 4 שעות ויש לי את הבעיות שלoverdigestion, הפחתה של כדאיות תא ולאחר מכן קובץ מצורף של תאים, כאשר לא מטופל כראוי. פרוטוקול זה מתאר את הנתיחה והכנת עור אנושי 4 מ"מ ביופסיה לגזירה של תרבות פיברובלסטים ויש לו אחוזי הצלחה גבוהה מאוד וזה חשוב בעת ההתמודדות עם דגימות רקמת מטופל הנגזרות. בתרבות זו, קרטינוציטים נודדים מרקמת הביופסיה בתוך השבוע הראשון לאחר הכנה. Fibroblasts להופיע 7-10 ימים לאחר התוצאה הראשונה של קרטינוציטים. תקשורת גלוקוז גבוהה DMEM בתוספת 20% FBS מעדיפה את הצמיחה של fibroblasts על קרטינוציטים וfibroblasts תהיה לגדול יותר את הקרטינוציטים. לאחר 2 קטעים כבר דילול את הקרטינוציטים וכתוצאה מתרבויות פיברובלסטים הומוגניות יחסית, המבטאת את סמן SERPINH1 פיברובלסטים (HSP-47). השימוש בגישה זו, ניתן לגזור 15-20 מיליון fibroblasts בשבועות 4-8 לבנקאות סלולרי. נתיחת העור לוקחת בערך 15-20 דקות, ולאחר מכן תאים מנוטרים פעם ביוםמתחת למיקרוסקופ, והתקשורת משתנה כל 2-3 ימים לאחר התקשרות ותולדה של תאים.

Protocol

עור אגרוף ביופסיה שהושגה באמצעות הליך רגיל ³ (המתקבל לדוגמה עם 4 מ"מ מכשיר Visipunch סיבוב) צריך להיות כל הזמן ב20% FBS DMEM מלא תקשורת על קרח. לאחר המדגם הגיע במעבדה, לעבד את הביופסיה בהקדם האפשרי.

1. הכנת עור אגרוף הביופסיה

צעדים 1.1-1.3 הם להיות מתבצעים בתוך biosafety CABINET

1. להכין מראש: הוסף 1 מ"ל של 0.1% לטין היטב בכל צלחת 6 באר. הגדר את הצלחת בצד ל30-60 דקות. לשאוב את פתרון ג'לטין ולהוסיף 800 μl של שלם DMEM/20% FBS תקשורת היטב כל אחד. ודא שכל פני השטח שלו מכוסה היטב עם תקשורת.
2. הפוך את המכסה של צלחת רקמת 10 ס"מ סטרילי תרבות ולהוסיף 1.5 מ"ל של DMEM / 20% FBS תקשורת לאמצע המכסה ונפרש טיפת התקשורת עם קצה פיפטה סרולוגית.
3. בעזרת מלקחיים סטריליים, מקום לאהוא חתיכת עור הביופסיה בתקשורת על הצלחת.

2. Dissection של עור אגרוף הביופסיה

שלבי 9 2.1-2.2 ARE להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי

1. הנח את החלק התחתון של צלחת 10 ס"מ על מכסה הפוך, ולהעביר את עור הביופסיה למיקרוסקופ לנתח במכסת מנוע הזרימה למינרית.
2. לנתח סיבוב 4 מ"מ עור ביופסיה ל12-15 חתיכות בגודל אחיד עם קצוות חדים על ידי חיתוך חתיכות בחצי שווים שימוש באחד אזמל כדי להחזיק את הביופסיה במקום שני והאזמל כדי לחתוך עם תנועה סיבובית בכיוון אחד. חתיכות עם קצוות משוננים לתרום לתולדת קובץ מצורף / תא עני.

3. העברת העור גזור ביופסיה חתיכות לתוך צלחות תרבית רקמה

צעדים הם 3.1-3.6 להתבצע בתוך biosafety CABINET

1. הנח את החלק התחתון של המנה תרבית רקמת 10 ס"מעל גבי מכסה ההפוך, ומנה בחזרה להעברה לארון הבטיחות הביולוגי.
2. בעזרת מלקחיים מחודדים, מקום 2-3 ביופסיה חתיכות לתוך באר כל הצלחת 6 היטב המוכנה המכילה 800 μl ולא על בארות יבשות. השתמש הקשה או הזזה תנועה כדי לקבל את החלקים לצרף לתחתית הבאר. אזמל הוא שימושי כדי להסיר כל חתיכות מביופסית המלקחיים.
3. מניחים את הצלחת 6 היטב ב37 ° C החממה. לפקח יומי כדי להבטיח שיש סרט של מדיה ציפוי תחתית הבאר בשבוע הראשון; להוסיף ~ 200 μl כל 2 ימים להחליף כל מדיה התאדתה.
4. אחרי שבוע אחד, להגדיל את כמות המדיה ל2 מ"ל של FBS DMEM/20% השלם ושינוי תקשורת כל 2-3 ימים.
5. ברגע שהם מחוברות fibroblasts היטב כל אחד לנקודה שבה fibroblasts מגיע לקצוות היטב, ומעבר Trypsinize צלחת 6 היטב לתוך צלוחיות T75 2X (קטע 1). ניתן להעביר את פיסות הרקמה גם כן. הם לא לצרף ולהישטף OUT במהלך שינוי המדיה הבאה.
6. ברגע שfibroblasts הם מחוברות, להעביר אותם לT175 צלוחיות 3x (קטע 2), הקפאה בתקשורת DMEM המלאה בתוספת 10% DMSO ב1x10 ⁶ תאים / מ"ל לבקבוקון.

4. אפיון את fibroblasts דרך Immunostaining

1. fibroblasts התרבות בשקופית 8 קאמריות גם מצופה בג'לטין.
2. כאשר תאים הם בשיעור 80% confluency, לשאוב את המדיום מכל אחד.
3. תקן תאים בparaformaldehyde 4% במשך עשר דקות בטמפרטורת חדר.
4. שטוף את זמני בארות 3 עם 1X PBS.
5. Permeabilize את התאים עם 150 μl של 0.3% טריטון X-100 (PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
6. שטוף את זמני בארות 3 עם 1X PBS.
7. הוסף 200 חסימת פתרון μl (סרום עיזים PBS + 5% רגיל (וקטור, S-1000)) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
8. הכן דילול 1:250 של Anti-SERPHIN-1 (נגד ארנב, מב, Sigma, S5950-200 μl) בחסימת פתרון.
9. spirate פתרון החסימה, ולהוסיף 150 μl של דילול 1:250 של AntiSERPINH-1. לדגור על 1-2 שעות בטמפרטורת חדר, או על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
10. שטוף את זמני בארות 3 עם 1X PBS.
11. הכן נוגדן חד שבטי עז נגד ארנב 1:200 (אלקסה פלואוריד עיזים נגד ארנב IgG (H + L), Invitrogen, A11008) בחסימת פתרון.
12. הוסף 150 μl של 1:200 נוגדן חד שבטי עז נגד ארנב היטב כל אחד. דגירה במשך שעה 1, בחושך, בטמפרטורת חדר.
13. לשטוף בארות פעם אחת עם 1xPBS.
14. לשאוב PBS, והרם בזהירות את התאים כדי לחשוף רק את השקופית.
15. הר השקופית עם 2-3 טיפות של הרכבה בינונית המכילות DAPI (וקטור, H-1200).
16. לנתח את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Representative Results

קרטינוציטים צומחים מתוך יצירות הביופסיה בהקדם 48 שעות לאחר ניתוח. תולדת fibroblasts הראשונה ניתן לראות כשבוע לאחר עיבוד. ברגע שהגיעו לבארות confluency, fibroblasts הוא passaged לשני קטעים נוספים כדי להגיע לשלוש צלוחיות 150 ס"מ (T150) ותאי cryopreserved. אנו מייצרים בשיטה זו 15-20 מיליון תאים. את fibroblasts הם חיוביים עבור אנטי SERPINH1 (הידוע גם בHSP-47) (איור 1), שהוא קולגן ספציפי מלווה מולקולרי מקומיים בreticulum endoplasmic. HSP47 ממלא תפקיד חיוני בסינתזת הקולגן בעור fibroblasts (קורודה, et al, 2004).

קו זמן

יום	תוחלת
יום 3 - יום 7	קובץ מצורף ותולדה של קרטינוציטים	יום 7 - יום 14	תולדה של fibroblasts
יום 25 ימים 35	Fibroblasts צריך לכסות את הצלחת 6 היטב וצריך להיות לpassaged לתוך צלוחיות 75 סנטימטר, מעבר פעם שנייה לתוך צלוחיות 150 סנטימטרים
יום 30 ימים 50	להקפיא למטה כמו 1Mio תאים / בקבוקון על תאי Mio 15-20 בתקשורת DMEM המלאה בתוספת 10% DMSO

איור 1. אימונוהיסטוכימיה אנטי SERPHIN1 של תרבות פיברובלסטים מטופל נגזרות עם counterstaining DAPI.

Discussion

עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג תרבויות טהורות יחסית של fibroblasts העור. יש את fibroblasts תכונות מורפולוגיות אופייניות של גופים מוארכים, דמויי כישור סלולרי, עגולים לגרעין תא סגלגל, ואת fibroblasts לגדול ומיושר בצרורות כאשר מחוברות. התקשורת תומכת בצמיחה של fibroblasts אילו אוכלוסיות תאי הקרטינוציטים אחרות כגון צריכים תוספים נוספים וגורמי גדילה, או שmitotically פחות פעילים, זה מאפשר לתרבויות פיברובלסטים טהורות יחסית.

את fibroblasts הוא passaged לאחר מכן עם טריפסין ב01:03 ליחס 1:5. התרבות מורחבת לכמות הרצויה של fibroblasts (15-20 מיליון) בתוך 4-8 שבועות.

שימוש בטכניקה זו, במעבדה שלנו נובעת מעל 70 קווים פיברובלסטים בהצלחה. אנחנו צריכים לבדוק את כל שורה לזיהום Mycoplasma ולהוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת הצמיחה כדי למנוע זיהום חיידקים אחר. עבוריתרבות explant nitial מצאנו כי 20% FBS בתקשורת תומך בצמיחה, עם זאת, מאוחר יותר בקטעי FBS 10% הוא מספיק. מדי פעם, אנו רואים תולדה ישירה של fibroblasts מחתיכות העור כנראה בשל זווית החיתוך של העור והסרת של האפידרמיס אשר מכיל קרטינוציטים.

טכניקה דומה באמצעות coverslip להחזיק את חתיכות העור הייתה פחות יעילה ^ב4 ידי שלנו. בשל התנועה של coverslip בתוך תרבות צלחת, גם כשטפל בזהירות רב, את חלקי העור לא ייחסו כמו שצריך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380
Table A. Table of specific reagents and equipments.
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163
Table B. Reagents.