Summary
मानव त्वचा पंच बायोप्सी से तंतुप्रसू explant संस्कृति प्रोटोकॉल एक कम बीतने संख्या में दस लाख के बारे में 15-20 कोशिकाओं की बैंकिंग के लिए 4-8 सप्ताह के भीतर त्वचा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक तकनीकी रूप से मजबूत और आसान तरीका है.
Abstract
रोग के साथ एक व्यक्ति से ली गई ऊतकों और सेल लाइनों रोग से संबंधित सेलुलर phenotypes अध्ययन करने के लिए आदर्श स्रोत हैं. इस प्रोटोकॉल में रोगी व्युत्पन्न fibroblasts के सफलतापूर्वक मॉडल रोग 1 से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की व्युत्पत्ति में इस्तेमाल किया गया है. इन fibroblasts की प्रारंभिक अंश भी विशिष्ट बीमारी रास्ते, तंत्र 2 और बाद में दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए सेल आधारित कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एंजाइमी प्रक्रियाओं पर प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लाभ 1) एंजाइमी उपचार का उपयोग पुराने रोगियों, पार्किंसंस रोग, 2 के साथ प्रभावित जैसे रोगियों) अधिक चुनौतीपूर्ण तरीके से अधिक तकनीकी रूप से सरल दृष्टिकोण से व्युत्पन्न ऊतक की छोटी मात्रा से तकनीक के reproducibility, और 3 रहे हैं ) समय ध्यान: इस प्रोटोकॉल 15-20 मिनट लगते हैं और बायोप्सी आने के बाद तुरंत किया जा सकता है. Enzymatic उपचार 4 घंटे तक का समय लग और की समस्या हो सकती हैसेल व्यवहार्यता और ठीक से संभाला नहीं जब कोशिकाओं के बाद कुर्की की overdigestion, कमी. इस प्रोटोकॉल में एक 4 मिमी मानव त्वचा एक तंतुप्रसू संस्कृति की व्युत्पत्ति के लिए बायोप्सी के विच्छेदन और तैयारी का वर्णन करता है और रोगी व्युत्पन्न ऊतक के नमूने से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है जो एक बहुत ही उच्च सफलता दर है. इस संस्कृति में, केरेटिनकोशिकाओं तैयारी के बाद पहले सप्ताह के भीतर बायोप्सी ऊतक से बाहर पलायन. Fibroblasts keratinocytes के पहले परिणाम के 7-10 दिन बाद दिखाई देते हैं. 20% FBS के साथ पूरक DMEM उच्च ग्लूकोज मीडिया केरेटिनकोशिकाओं और fibroblasts अधिक fibroblasts की वृद्धि केरेटिनकोशिकाओं बढ़ना होगा पक्ष में है. 2 मार्ग के बाद केरेटिनकोशिकाओं तंतुप्रसू मार्कर SERPINH1 (HSP-47) को व्यक्त करता है जो अपेक्षाकृत समरूप तंतुप्रसू संस्कृतियों में जिसके परिणामस्वरूप बाहर पतला कर दिया गया है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, 15-20000000 fibroblasts सेल बैंकिंग के लिए 4-8 सप्ताह में प्राप्त किया जा सकता है. त्वचा विच्छेदन 15-20 मिनट का समय लगता है, कोशिकाओं तो एक दिन में एक बार निगरानी कर रहे हैंखुर्दबीन के नीचे, और मीडिया हर 2-3 दिनों लगाव और कोशिकाओं के परिणाम के बाद बदल गया है.
Protocol
पंच बायोप्सी मानक प्रक्रिया 3 (जैसे 4mm दौर Visipunch साधन प्राप्त के साथ) का उपयोग कर प्राप्त त्वचा बर्फ पर पूरा DMEM 20% FBS के मीडिया में रखा जाना चाहिए. एक बार नमूना प्रयोगशाला में आ गया है, जल्द से जल्द बायोप्सी की प्रक्रिया.
1. त्वचा पंच बायोप्सी की तैयारी
कदम 1.1-1.3 एक जैव सुरक्षा कैबिनेट अंदर प्रदर्शन किया जाना है
- अग्रिम में तैयार: 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से जिलेटिन 0.1% से 1 मिलीलीटर जोड़ें. 30-60 मिनट के लिए अलग प्लेट सेट करें. जिलेटिन समाधान महाप्राण और एक अच्छी तरह से पूरा DMEM/20% FBS के मीडिया के 800 μl जोड़ें. अच्छी तरह से पूरी सतह मीडिया के साथ कवर किया जाता है सुनिश्चित करें.
- एक बाँझ 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के ढक्कन उलटें और ढक्कन के बीच करने के लिए 1.5 DMEM के मिलीग्राम / 20% FBS के मीडिया जोड़ने और सीरम वैज्ञानिक पिपेट की नोक के साथ मीडिया ड्रॉप बाहर फैल गया.
- एक बाँझ संदंश का प्रयोग, जगह टीवह त्वचा पकवान पर मीडिया में टुकड़ा बायोप्सी.
2. त्वचा पंच बायोप्सी के विच्छेदन
9 2.1-2.2 कदम एक क्षैतिज लामिना का प्रवाह हुड के अंदर प्रदर्शन किया जा रहा हैं
- उल्टे ढक्कन पर 10 सेमी पकवान के नीचे के हिस्से, जगह और त्वचा लामिना का प्रवाह हुड में विदारक माइक्रोस्कोप के लिए बायोप्सी हस्तांतरण.
- जगह में बायोप्सी धारण करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए और एक ही दिशा में एक रोलिंग गति के साथ कटौती करने के लिए दूसरे स्केलपेल बराबर हिस्सों में टुकड़े काटने से तेज किनारों के साथ 12-15 बराबर आकार के टुकड़ों में एक 4 मिमी दौर त्वचा बायोप्सी काटना. प्रचंड किनारों के साथ टुकड़े गरीब लगाव / सेल परिणाम के लिए योगदान करते हैं.
3. Dissected त्वचा का स्थानांतरण टिशू कल्चर प्लेट्स में मोहरे बायोप्सी
कदम 3.1-3.6 एक जैव सुरक्षा कैबिनेट अंदर प्रदर्शन किया जाना है
- 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के नीचे हिस्से पर रखेंउल्टे ढक्कन, और हस्तांतरण पकवान के शीर्ष पर वापस जैव सुरक्षा कैबिनेट में.
- सूखे कुओं पर 800 μl और नहीं युक्त तैयार 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक उठाई संदंश, जगह 2-3 बायोप्सी टुकड़े का उपयोग करना. टुकड़ों में अच्छी तरह से नीचे करने के लिए संलग्न करने के लिए प्राप्त करने की गति दोहन या फिसलने का प्रयोग करें. एक स्केलपेल संदंश से किसी भी बायोप्सी टुकड़े को दूर करने के लिए उपयोगी है.
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली रखें. किसी भी सुखाया मीडिया को बदलने के लिए हर 2 दिन ~ 200 μl जोड़ने, मीडिया कोटिंग के पहले सप्ताह के लिए अच्छी तरह से नीचे की एक फिल्म नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए दैनिक मॉनिटर.
- एक सप्ताह के बाद, पूरा DMEM/20% FBS और परिवर्तन मीडिया हर 2-3 दिन के 2 मिलीलीटर के लिए मीडिया की मात्रा में वृद्धि.
- एक बार fibroblasts fibroblasts 2X T75 बोतल (1 बीतने) में अच्छी तरह से, Trypsinize और पारित होने के 6 अच्छी तरह से थाली के किनारों तक पहुंच रहे हैं इस मुद्दे पर जहां प्रत्येक कुएं में मिला हुआ है. ऊतक टुकड़े अच्छी तरह के रूप में स्थानांतरित किया जा सकता है. वे ओ देते नहीं है और धोया जाअगले मीडिया परिवर्तन के दौरान केन्द्र शासित प्रदेशों.
- एक बार fibroblasts मिला हुआ हैं, 3X T175 बोतल (बीतने 2), पूरा DMEM मीडिया में फ्रीज प्लस 1x10 6 कोशिकाओं / शीशी प्रति मिलीलीटर में 10% DMSO के लिए उन्हें स्थानांतरित.
4. Immunostaining के माध्यम से कैरेक्टराइजेशन Fibroblasts
- 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड में संस्कृति fibroblasts जिलेटिन के साथ लेपित.
- कोशिकाओं confluency 80% से कम कर रहे हैं, प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम aspirate.
- कमरे के तापमान पर दस मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक करें.
- 1X पीबीएस के साथ कुओं 3 बार धोएं.
- 0.3% की 150 μl के साथ कोशिकाओं Permeabilize ट्राइटन कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक्स 100 (पीबीएस में).
- 1X पीबीएस के साथ कुओं 3 बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 200 μl अवरुद्ध समाधान (पीबीएस + 5% सामान्य बकरी सीरम (वेक्टर, एस -1000)) जोड़ें.
- अवरुद्ध समाधान में विरोधी SERPHIN -1 (एंटी खरगोश, एमएबी, सिग्मा, S5950-200 μl) की एक 1:250 कमजोर पड़ने को तैयार है.
- एकअवरुद्ध समाधान spirate, और AntiSERPINH -1 के 1:250 कमजोर पड़ने के 150 μl जोड़ें. कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे सेते हैं, या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर.
- 1X पीबीएस के साथ कुओं 3 बार धोएं.
- अवरुद्ध समाधान में एक 1:200 बकरी विरोधी खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एलेक्सा Fluor बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल), Invitrogen, A11008) तैयार करें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1:200 बकरी विरोधी खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 150 μl जोड़ें. कमरे के तापमान पर, अंधेरे में, 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- 1XPBS के साथ एक बार कुओं धो लें.
- पीबीएस महाप्राण, और ध्यान से सिर्फ स्लाइड प्रकट करने के लिए कक्षों से उठा.
- DAPI (वेक्टर, एच 1200) से युक्त बढ़ते मध्यम की 2-3 बूंदों के साथ स्लाइड माउंट.
- एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे स्लाइड का विश्लेषण करें.
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Representative Results
Keratinocytes विच्छेदन के बाद 48 घंटे के रूप में जल्द ही बायोप्सी टुकड़े से बाहर बढ़ रहा है. पहले fibroblasts के परिणाम के बारे में एक सप्ताह के प्रसंस्करण के बाद देखा जा सकता है. कुओं confluency पर पहुंच गया है एक बार, fibroblasts के तीन 150 सेमी बोतल (T150) तक पहुंचने के लिए दो और मार्ग के लिए passaged कर रहे हैं और कोशिकाओं cryopreserved रहे हैं. हम इस विधि 15-20000000 कोशिकाओं के साथ उत्पन्न करते हैं. fibroblasts जालिका में स्थानीय एक कोलेजन विशिष्ट आणविक निगरानी है जो विरोधी SERPINH1 (भी HSP-47 के रूप में जाना जाता है) (चित्रा 1) के लिए सकारात्मक हैं. HSP47 त्वचा fibroblasts में कोलेजन जैवसंश्लेषण (कुरोडा, एट अल, 2004) में एक आवश्यक भूमिका निभाता है.
समय रेखा
| दिन | उम्मीद | ||
| दिन 3 - 7 दिन | Keratinocytes के लगाव और परिणाम | दिन 7 - 14 दिन | Fibroblasts के परिणाम |
| दिन के 25 दिन के लिए 35 | Fibroblasts 6 अच्छी तरह से थाली को कवर करना चाहिए और 150cm बोतल में 75cm बोतल, पारित होने के एक दूसरे समय में passaged के लिए होना चाहिए | ||
| दिन 30 दिन 50 | पूरा DMEM मीडिया प्लस 10% DMSO में 15-20 Mio कोशिकाओं के बारे में 1Mio कोशिकाओं / शीशी के रूप में नीचे रुक |
चित्रा 1. DAPI counterstaining साथ रोगी व्युत्पन्न fibroblast संस्कृति के विरोधी SERPHIN1 immunohistochemistry.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के साथ, त्वचा fibroblasts की अपेक्षाकृत शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त किया जा सकता है. fibroblasts के अंडाकार सेल नाभिक को दौर लम्बी, धुरी की तरह सेल निकायों की विशेषता रूपात्मक विशेषताएं हैं, और जब मिला हुआ fibroblasts के गठबंधन और बंडलों में हो जाना. मीडिया fibroblasts की वृद्धि जैसे केरेटिनकोशिकाओं अतिरिक्त खुराक और वृद्धि कारकों की जरूरत है, या mitotically कम सक्रिय हैं अन्य सेल आबादी है, जबकि यह अपेक्षाकृत शुद्ध तंतुप्रसू संस्कृतियों के लिए अनुमति देता है समर्थन करता है.
fibroblasts के बाद 01:05 के अनुपात में एक 1:03 पर trypsin के साथ passaged हैं. संस्कृति 4-8 सप्ताह के भीतर fibroblasts की वांछित मात्रा (15-20 करोड़ डॉलर) का विस्तार किया है.
इस तकनीक का उपयोग करना, हमारी प्रयोगशाला सफलतापूर्वक 70 तंतुप्रसू लाइनों पर शामिल किया गया. हम mycoplasma संदूषण के लिए हर लाइन का परीक्षण किया और अन्य जीवाणु संक्रमण से बचने के लिए विकास मीडिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ दिया है. मैं के लिएnitial explant संस्कृति हम मीडिया में 20% FBS के बाद 10% FBS के अंश में, हालांकि, वृद्धि का समर्थन करता पाया कि पर्याप्त है. कभी कभी, हम त्वचा और केरेटिनकोशिकाओं होता है जो बाह्य त्वचा को हटाने के काटने के कोण करने के लिए संभवतः के कारण त्वचा के टुकड़े से fibroblasts की एक सीधा परिणाम निरीक्षण करते हैं.
त्वचा टुकड़े नीचे पकड़ करने के लिए एक coverslip का उपयोग कर एक ऐसी ही तकनीक हमारे हाथ 4 में कम प्रभावी था. भीतर coverslip के आंदोलन के कारण संस्कृति डिश भी साथ संभाला जब महान देखभाल त्वचा टुकड़े ठीक से संलग्न नहीं किया.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल के विकास पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम, TR1-01246) और पार्किंसंस गठबंधन द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
|||
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
