Summary
Le protocole de culture d'explants de fibroblastes humains à partir de biopsies de perforation de la peau est une façon techniquement robuste et simple à dériver des cellules de la peau dans les 4-8 semaines pour la banque d'environ 15-20 millions de cellules dans un certain nombre de passage faible.
Abstract
Les tissus et des lignées cellulaires dérivées d'un individu avec la maladie sont des sources idéales pour étudier les phénotypes cellulaires liés à la maladie. Fibroblastes provenant de patients dans ce protocole ont été utilisées avec succès dans l'obtention de cellules souches pluripotentes induites à la maladie de modèle 1. Les premiers passages de ces fibroblastes peuvent également être utilisés pour des tests fonctionnels à base de cellules pour étudier les voies spécifiques de la maladie, les mécanismes et les approches 2 ultérieures de dépistage de drogues. L'avantage du protocole présenté sur les procédures enzymatiques sont 1) la reproductibilité de la technique à partir de petites quantités de tissu provenant de patients âgés, par exemple des patients atteints de la maladie de Parkinson, 2) L'approche techniquement simple sur des méthodologies plus complexes en utilisant des traitements enzymatiques, et 3 ) la prise en compte du temps: ce protocole prend 15-20 minutes et peut être effectuée immédiatement après la biopsie arrivée. Traitements enzymatiques peuvent prendre jusqu'à 4 heures et ont des problèmes dedigestion excessive, la réduction de la viabilité cellulaire et la fixation ultérieure de cellules non traitées correctement. Ce protocole décrit la dissection et la préparation d'une peau humaine 4 mm biopsie pour la dérivation d'une culture de fibroblastes et a un taux de réussite très élevé qui est important dans le cas des échantillons de tissus provenant de patients. Dans cette culture, les kératinocytes migrent hors de la biopsie dans la première semaine après sa préparation. Fibroblastes apparaissent 7-10 jours après la première excroissance des kératinocytes. Médias élevés de glucose DMEM supplémenté avec 20% de FBS favorise la croissance des fibroblastes sur kératinocytes et fibroblastes va envahir les kératinocytes. Après 2 passages kératinocytes ont été dilués en résultant dans des cultures de fibroblastes relativement homogènes qui expriment le marqueur SERPINH1 de fibroblastes (HSP-47). En utilisant cette approche, 15-20 millions fibroblastes peuvent être obtenues dans 4-8 semaines pour les banques de cellules. La dissection de la peau prend environ 15-20 min, les cellules sont ensuite contrôlés une fois par joursous le microscope, et les médias est changée tous les 2-3 jours après la fixation et excroissance de cellules.
Protocol
La peau biopsie obtenue en utilisant la procédure standard 3 (par exemple obtenu avec 4mm instrument de Visipunch tour) doit être conservé dans du DMEM complet 20% FBS sur la glace. Une fois que l'échantillon est arrivé dans le laboratoire, traiter la biopsie dès que possible.
1. Préparation de la peau biopsie
ÉTAPES 1.1 à 1.3 doivent être effectués DANS UN enceinte de sécurité biologique
- Préparez à l'avance: Ajouter 1 ml de gélatine à 0,1% dans chaque puits d'une plaque à 6 puits. Placer la plaque de côté pendant 30-60 min. Aspirer la solution de gélatine et ajouter 800 ul de complet DMEM/20% FBS à chaque puits. S'assurer que toute la surface du puits est recouverte de médias.
- Retourner le couvercle d'une boîte de culture cm stérile 10 de tissu et ajouter 1,5 ml de DMEM / 20% FBS médias au milieu du couvercle et étaler la goutte support avec la pointe de la pipette sérologique.
- En utilisant une pince stérile, endroit til biopsie cutanée pièce dans les médias sur le plat.
2. Dissection de la peau biopsie
ÉTAPES 9 2.1-2.2 doivent être effectués DANS UN HORIZONTAL hotte à flux laminaire
- Placer la partie inférieure de boîte de 10 cm sur le couvercle inversé, et le transfert de la biopsie cutanée au microscope à dissection dans la hotte à flux laminaire.
- Disséquer une ronde de 4 mm biopsie de la peau en 12-15 morceaux de taille égale avec des arêtes vives par la découpe de pièces en deux moitiés égales en utilisant un scalpel pour maintenir la biopsie en place et la deuxième scalpel pour couper avec un mouvement de roulement dans une direction. Pièces avec des bords irréguliers contribuent à une mauvaise fixation / cellule excroissance.
3. Transfert de la peau disséquée biopsie pièces dans les tissus des plaques de culture
Des mesures sont 3,1-3,6 SE FAIRE DANS UN enceinte de sécurité biologique
- Placer la partie inférieure de la boîte de culture cm 10 tissulairesur le dessus du couvercle inversé, et le plat de transfert de retour dans le poste de sécurité microbiologique.
- En utilisant une pince pointue, place 2-3 biopsie morceaux dans chaque puits de la plaque de 6 puits préparée contenant 800 ul et non sur des puits secs. Utilisez tapotant ou en glissant le mouvement pour obtenir les pièces à joindre au fond du puits. Un scalpel est utile pour enlever les morceaux de biopsie de la pince.
- Placer la plaque de 6 puits dans les 37 ° C incubateur. Surveiller tous les jours pour s'assurer qu'il s'agit d'un film de revêtement médias le fond du puits pendant la première semaine; ajouter ~ 200 pl tous les 2 jours à remplacer le support évaporé.
- Après une semaine, augmenter quantité de support à 2 ml de complet DMEM/20% de FBS et le changement des médias tous les 2-3 jours.
- Une fois que les fibroblastes sont confluentes dans chaque puits au point où les fibroblastes atteignent les bords de la plaque de 6 puits bien, Trypsiniser et passage en 2X T75 flacons (passage 1). Les pièces de tissu peuvent être transférées ainsi. Ils ne vont pas attacher et être lavé out pendant le changement de support suivante.
- Une fois que les fibroblastes sont confluents, les transférer à 3X flacons T175 (passage 2), le gel en toute milieu DMEM plus 10% de DMSO à 1x10 6 cellules / ml par flacon.
4. Caractérisation des fibroblastes par Immunocoloration
- fibroblastes de la culture dans 8 lame de chambre bien enduits avec de la gélatine.
- Lorsque les cellules sont à 80% de confluence, aspirer le milieu de chaque puits.
- Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde 4% pendant dix minutes à la température ambiante.
- Laver les puits 3 fois avec du PBS 1X.
- Perméabiliser les cellules avec 150 pi de 0,3% de Triton X-100 (dans PBS) pendant 5 min à température ambiante.
- Laver les puits 3 fois avec du PBS 1X.
- Ajouter 200 ul de solution de blocage (PBS + 5% sérum de chèvre normal (Vector, S-1000)) pendant 1 heure à température ambiante.
- Préparer une dilution 1:250 d'Anti-SERPHIN-1 (anti-lapin, MAB, Sigma, S5950-200 pi) dans une solution de blocage.
- ASpirate la solution de blocage et ajouter 150 ul de la dilution 1:250 de AntiSERPINH-1. Incuber à 1-2 heures à la température ambiante ou à 4 ° C pendant la nuit.
- Laver les puits 3 fois avec du PBS 1X.
- Préparer un anticorps monoclonal de chèvre anti-lapin 1:200 (Alexa Fluor chèvre anti-IgG (H + L), Invitrogen, A11008) dans une solution de blocage.
- Ajouter 150 pi de 1:200 anticorps monoclonal de chèvre anti-lapin dans chaque puits. Incuber pendant 1 heure, dans l'obscurité, à température ambiante.
- Laver les puits une fois avec 1xPBS.
- Aspirer le PBS, et soulevez délicatement les chambres pour révéler tout le diaporama.
- Monter la lame avec un 2-3 gouttes de milieu de montage contenant DAPI (Vector, H-1200).
- Analyser la lame sous un microscope à fluorescence.
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Representative Results
Kératinocytes croissante sur les pièces de biopsie dès 48 h après dissection. Première fibroblastes excroissance peut être observé environ une semaine après le traitement. Une fois que les puits ont atteint la confluence, les fibroblastes sont repiquées pour deux passages pour atteindre trois flacons de 150 cm (T150) et les cellules sont cryoconservés. Nous générons avec cette méthode 15-20 millions cellules. Les fibroblastes sont positifs en anticorps anti-SERPINH1 (également connu sous le HSP-47) (figure 1), qui est un collagène spécifique au chaperon moléculaire localisée dans le réticulum endoplasmique. HSP47 joue un rôle essentiel dans la biosynthèse du collagène dans les fibroblastes de la peau (Kuroda et al, 2004).
TIME LINE
| Journée | Espérance | ||
| Jour 3 - Jour 7 | Attachement et excroissance des kératinocytes | Jour 7 - Jour 14 | Excroissance des fibroblastes |
| Jour 25 Jour 35 | Fibroblastes devraient couvrir la plaque à 6 puits et doivent être repiquées dans des flacons 75cm, passage une deuxième fois dans des flacons 150cm | ||
| Jour 30 Journée 50 | Congeler bas que 1Mio cellules / flacon sur les cellules Mio 15-20 dans les médias complet DMEM plus 10% de DMSO |
Figure 1. D'immunohistochimie anti-SERPHIN1 de culture de fibroblastes dérivé du patient avec DAPI contre-coloration.
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Discussion
Avec ce protocole, les cultures relativement pures de fibroblastes de la peau peuvent être obtenues. Les fibroblastes ont des caractéristiques morphologiques caractéristiques des corps cellulaires, broche en forme allongées, rondes à noyaux des cellules ovales, et les fibroblastes se développent alignés et en paquets lorsque confluent. Les médias favorise la croissance des fibroblastes alors que d'autres populations de cellules kératinocytes par exemple besoin de suppléments additionnels et les facteurs de croissance, ou mitose sont moins actives, ce qui permet aux cultures de fibroblastes relativement purs.
Les fibroblastes sont ensuite repiquées avec de la trypsine dans un rapport de 1:3 à 1:5. La culture est développée à la quantité désirée de fibroblastes (15-20 M) à l'intérieur de 4-8 semaines.
Grâce à cette technique, notre laboratoire a tiré plus de 70 lignées de fibroblastes succès. Nous avons testé toutes les lignes de contamination par des mycoplasmes et ajouter des antibiotiques pour les milieux de croissance pour éviter toute autre contamination bactérienne. Pour le iculture des explants préside d'abord nous avons constaté que 20% de FBS dans les médias soutient la croissance, cependant, dans les passages plus tard, 10% FBS est suffisante. De temps en temps, nous observons une conséquence directe des fibroblastes des morceaux de peau sans doute en raison de l'angle de coupe de la peau et la suppression de l'épiderme qui contient des kératinocytes.
Une technique similaire utilisant une lamelle de maintenir enfoncé les morceaux de peau était moins efficace entre nos mains 4. En raison du mouvement de la lamelle dans la culture plat, même lorsqu'ils sont manipulés avec beaucoup de soin, les morceaux de peau n'ont pas attaché correctement.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
L'élaboration de ce protocole a été financé par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) et de Parkinson Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
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| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
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References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
