Summary
Die Fibroblasten Explantatkultur Protokoll aus der menschlichen Haut Stanzbiopsien ist eine technisch robuste und einfache Weise abzuleiten Hautzellen innerhalb von 4-8 Wochen für Banken von etwa 15-20 Millionen Zellen auf einem niedrigen Durchgang Nummer.
Abstract
Geweben und Zelllinien von einem Individuum mit der Krankheit abgeleitet sind eine ideale Quelle zu krankheitsbedingten zellulären Phänotypen zu studieren. Patienten stammenden Fibroblasten in diesem Protokoll wurden erfolgreich in der Ableitung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu modellieren Krankheit 1 verwendet. Frühen Passagen dieser Fibroblasten können auch zellbasierten funktionellen Assays verwendet werden, um spezifische Krankheitsbahnen Mechanismen 2 und nachfolgende Wirkstoff-Screening-Ansätzen zu studieren. Der Vorteil der vorgestellten Protokoll über enzymatische Verfahren sind 1) die Reproduzierbarkeit der Technik von kleinen Mengen von Gewebe von älteren Patienten, zB Patienten mit Parkinson-Krankheit, 2 betroffen) der technisch einfachen Ansatz über schwierigere Methoden mittels enzymatischer Behandlungen abgeleitet und 3 ) die Zeit berücksichtigt: Dieses Protokoll dauert 15-20 min und kann sofort nach der Ankunft Biopsie durchgeführt werden. Enzymatische Behandlungen kann bis zu 4 Stunden und haben die Probleme deroverdigestion, Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen und die anschließende Befestigung der Zellen, wenn sie nicht richtig gehandhabt. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation und Herstellung einer 4-mm menschlichen Hautbiopsie zur Ableitung eines Fibroblasten-Kultur und hat eine sehr hohe Erfolgsquote, die wichtig ist, wenn man mit einem Patienten abgeleitete Gewebeproben. In dieser Kultur, Migration Keratinozyten aus der Biopsie Gewebe innerhalb der ersten Woche nach der Zubereitung. Fibroblasten erscheinen 7-10 Tage nach der ersten Folge von Keratinozyten. DMEM high glucose Medium mit 20% FBS begünstigt das Wachstum von Fibroblasten in Keratinozyten und Fibroblasten werden die Keratinozyten überwuchern. Nach 2 Passagen Keratinozyten wurden durchgeführt, was zu relativ homogenen Fibroblastenkulturen die die Fibroblasten-Marker SERPINH1 (HSP-47) drückt verdünnt. Mit diesem Ansatz können 15-20 Millionen Fibroblasten in 4-8 Wochen für die Zell-Banking abgeleitet werden. Die Haut Präparation dauert etwa 15-20 min werden die Zellen dann überwacht einmal täglichunter dem Mikroskop und Medien alle 2-3 Tage nach der Befestigung und Auswachsen der Zellen verändert.
Protocol
Die Haut Stanzbiopsie unter Verwendung Standardverfahren 3 (zB mit 4mm lang Visipunch Instrument erhalten) sollten in komplettem DMEM 20% FBS Medien auf Eis gehalten werden. Nachdem die Probe im Labor angekommen, verarbeiten die Biopsie so schnell wie möglich.
1. Vorbereitung der Haut Stanzbiopsie
STEPS 1,1-1,3 SIND IN EINEM Biosicherheitswerkbank DURCHZUFÜHRENDEN
- Bereiten Sie im Voraus: In 1 ml 0,1% Gelatine in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Stellen Sie den Teller beiseite für 30-60 min. Saugen Sie die Gelatine-Lösung und fügen Sie 800 ul komplette DMEM/20% FBS Medien in jede Vertiefung. Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche des Bohrlochs mit Medien abgedeckt wird.
- Kehren Sie die Deckel eines sterilen 10 cm Gewebekulturschale und fügen Sie 1,5 ml DMEM / 20% FBS Medien auf die Mitte des Deckels und breitete die Medien Tropfen mit der Spitze des serologischen Pipette.
- Mit einer sterilen Pinzette Platz ter Hautbiopsie Stück in den Medien auf dem Teller.
2. Dissektion der Haut Stanzbiopsie
STEPS 9 2.1-2.2 SIND IN EINEM HORIZONTAL Laminarströmungshaube DURCHZUFÜHRENDEN
- Setzen Sie den unteren Teil 10 cm Schale auf umgekehrten Deckel, und übertragen Sie die Haut an den Binokular im Laminarströmungshaube Biopsie.
- Präparieren Sie ein 4-mm rund Hautbiopsie in 12-15 gleich große Stücke mit scharfen Kanten durch Schneiden Stücke in gleiche Hälften mit einem Skalpell, um die Biopsie in Position zu halten und die zweite Skalpell mit einer rollenden Bewegung in eine Richtung geschnitten. Stücke mit ausgefranste Kanten tragen zur schlechten Befestigung / Zelle Auswuchs.
3. Übertragung von Dissected Hautbiopsie Pieces in Zellkulturplatten
STEPS 3.1-3.6 SIND IN EINEM Biosicherheitswerkbank DURCHZUFÜHRENDEN
- Platzieren des Bodenabschnitts des 10 cm Zellkulturschalenauf der Oberseite der umgedrehten Deckel und Schüssel Transfer zurück in die Biosicherheitswerkbank.
- Mit einem spitzen Pinzette, Platz 2-3 Biopsie Stücke in jede Vertiefung der vorbereiteten 6-Well-Platte mit 800 ul und nicht auf trockenen Brunnen. Verwenden Sie tippen oder gleitende Bewegung um die Stücke auf den Grund des Brunnens zu befestigen. Ein Skalpell ist nützlich, um keine Biopsie Stücke aus der Zange entfernen.
- Legen Sie die 6-Well-Platte in der 37 ° C-Inkubator. Überwachen Sie täglich, um sicherzustellen, es ist ein Film von Medien Beschichtung der Boden der gut für die erste Woche, fügen ~ 200 ul alle 2 Tage, um alle verdampft Medien zu ersetzen.
- Nach einer Woche erhöhen Anzahl der Medien bis 2 ml komplettem DMEM/20% FBS und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
- Sobald Fibroblasten sind in jeder Vertiefung konfluenten bis zu dem Punkt, wo die Fibroblasten Erreichen der Kanten der Bohrung, trypsinize und Kanal 6-Well-Platte in 2X T75-Flaschen (Kanal 1). Die Gewebestücke werden mit übertragen werden. Sie werden nicht an und gewaschen werden out bei der nächsten Änderung Medien.
- Sobald Fibroblasten konfluent sind, übertragen Sie sie auf 3X T175-Flaschen (Durchgang 2), frieren in komplettem DMEM Medium plus 10% DMSO bei 1x10 6 Zellen / ml pro Fläschchen.
4. Charakterisierung der Fibroblasten durch Immunfärbung
- Kultur Fibroblasten in 8 gut Kammerobjektträgers mit Gelatine beschichtet.
- Wenn die Zellen bei 80% Konfluenz sind, Saugen Sie das Medium aus jedem Well.
- Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd für zehn Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
- Waschen Sie die Wells 3-mal mit 1X PBS.
- Permeabilisierung der Zellen mit 150 ul 0,3% Triton X-100 (in PBS) für 5 min bei Raumtemperatur gerührt.
- Waschen Sie die Wells 3-mal mit 1X PBS.
- Jeweils 200 ul Blockierungslösung (PBS + 5% normalem Ziegenserum (Vector, S-1000)) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:250 Anti-Rilit-1 (Anti-Kaninchen, mAB, Sigma, S5950-200 ul) in Blocking-Lösung.
- Aspirate Blocking-Lösung, und fügen Sie 150 ul der 1:250 Verdünnung AntiSERPINH-1. Inkubation bei 1-2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht.
- Waschen Sie die Wells 3-mal mit 1X PBS.
- Bereiten Sie eine 1:200 Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper (Alexa Fluor Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H + L), Invitrogen, A11008) in Blocking-Lösung.
- In 150 ul 1:200 Ziege-Anti-Kaninchen monoklonaler Antikörper in jede Vertiefung. Inkubation für 1 h in der Dunkelheit bei Raumtemperatur.
- Waschen Vertiefungen einmal mit 1xPBS.
- Saugen Sie die PBS, und heben Sie die Kammern aus, um nur die Folie zu offenbaren.
- Befestigen Sie die Folie mit einem 2-3 Tropfen Eindeckmedium enthält DAPI (Vector, H-1200).
- Analysieren der Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Keratinozyten wachsen aus der Biopsie Stücke, sobald 48 Stunden nach der Sektion. Erste Fibroblasten Auswuchs kann etwa eine Woche nach der Verarbeitung zu beachten. Sobald die Brunnen Konfluenz erreicht haben, sind Fibroblasten für zwei weitere Passagen passagiert zu drei 150 cm Kolben (T150) zu erreichen und die Zellen werden kryokonserviert. Wir erzeugen mit dieser Methode 15-20 Millionen Zellen. Die Fibroblasten sind für anti-SERPINH1 (auch als HSP-47 bekannt) (Abbildung 1), die ein Kollagen-spezifischen molekularen Chaperon im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist positiv. HSP47 spielt eine wesentliche Rolle bei der Kollagen-Biosynthese in Hautfibroblasten (Kuroda et al, 2004).
TIME LINE
| Day | Erwartung | ||
| Tag 3 - Tag 7 | Anhänge und Auswuchs von Keratinozyten | Tag 7 - Tag 14 | Outgrowth von Fibroblasten |
| Tag 25-Day 35 | Fibroblasten sollte sich auf die 6-Well-Platte und sollte für in 75cm-Kolben, Durchgang ein zweites Mal in 150cm Flaschen passagiert | ||
| Tag 30-Day 50 | Frieren Sie sich wie 1Mio Zellen / Flasche etwa 15-20 Mio Zellen in komplettem DMEM Medium plus 10% DMSO |
Abbildung 1. Anti-SERPHIN1 Immunhistochemie von Patienten stammende Fibroblastenkultur mit DAPI Gegenfärbung.
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Discussion
Mit diesem Protokoll kann relativ reine Kulturen von Fibroblasten gewonnen werden. Die Fibroblasten weisen charakteristische morphologische Merkmale von langgestreckten, spindelförmigen Zellkörper, runde bis ovale Zellkerne und die Fibroblasten wachsen ausgerichtet und in Bündeln, wenn konfluent. Das Medium unterstützt das Wachstum von Fibroblasten während andere Zellpopulationen zB Keratinozyten benötigen Zusatzgebühren und Wachstumsfaktoren oder sind mitotisch weniger aktiv, ermöglicht dies eine relativ reinem Fibroblasten-Kulturen.
Die Fibroblasten werden anschließend mit Trypsin bei einem Verhältnis von 1.03 bis 01.05 passagiert. Die Kultur wird auf die gewünschte Menge von Fibroblasten (15-20 Millionen) innerhalb von 4-8 Wochen expandiert.
Mit dieser Technik hat sich unser Labor über 70 Fibroblasten-Linien erfolgreich abgeleitet. Wir haben jede Zeile für Mykoplasmen getestet und fügen Antibiotika zum Nährmedium auf andere bakterielle Kontamination zu vermeiden. Für den initial Explantatkultur wir festgestellt, dass 20% FBS in den Medien das Wachstum unterstützt, jedoch in späteren Passagen 10% FBS ausreichend. Gelegentlich beobachten wir eine direkte Folge von Fibroblasten aus der Haut Stücke vermutlich aufgrund der Schnittwinkel der Haut und der Entfernung der Oberhaut, die Keratinozyten enthält.
Eine ähnliche Technik mit einem Deckglas, halten Sie die Haut Stück war weniger effektiv in unsere Hände 4. Durch die Bewegung des Deckglases in Kulturschale, selbst wenn mit großer Sorgfalt behandelt, die Hautstücke nicht richtig befestigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Entwicklung dieses Protokoll wurde von der California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) und Parkinson Allianz finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
|||
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
