Summary
Il protocollo cultura espianto di fibroblasti da biopsie cutanee umane è un modo tecnicamente robusto e semplice per ricavare cellule della pelle all'interno di 4-8 settimane per il settore bancario di circa 15-20 milioni di cellule in un numero basso passaggio.
Abstract
Tessuti e linee cellulari derivate da un individuo con malattia sono fonti ideali per studiare fenotipi cellulari correlate alla malattia. Fibroblasti derivati da pazienti in questo protocollo sono stati utilizzati con successo nella derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte alla malattia modello 1. Primi passi di questi fibroblasti possono anche essere utilizzati per saggi funzionali a base di cellule per studiare percorsi specifici di malattia, meccanismi 2 e successive approcci di screening di stupefacenti. Il vantaggio del protocollo presentato nel corso procedure enzimatiche sono 1) la riproducibilità della tecnica di piccole quantità di tessuti derivati da pazienti anziani, ad esempio, pazienti affetti da morbo di Parkinson, 2) l'approccio tecnicamente semplice su metodologie più impegnativi utilizzando trattamenti enzimatici, e 3 ) il corrispettivo tempo: questo protocollo richiede 15-20 minuti e può essere eseguita subito dopo la biopsia arrivo. Trattamenti enzimatici possono richiedere fino a 4 ore e hanno i problemi dioverdigestion, riduzione della vitalità cellulare e la successiva collocazione delle cellule quando non gestita correttamente. Questo protocollo descrive la dissezione e la preparazione di una pelle umana 4 mm per biopsia derivazione di una coltura di fibroblasti e ha un tasso di successo molto alto che è importante quando si tratta di campioni di tessuti derivati da pazienti. In questa cultura, cheratinociti migrano fuori dal tessuto biopsia entro la prima settimana dopo la preparazione. I fibroblasti compaiono 7-10 giorni dopo la prima conseguenza di cheratinociti. DMEM High Media glucosio addizionato con 20% FBS favorisce la crescita dei fibroblasti su cheratinociti e fibroblasti sarà invadere i cheratinociti. Dopo 2 passaggi cheratinociti sono stati diluiti in colture di fibroblasti con conseguente relativamente omogenei che esprime la fibroblasti marcatore SERPINH1 (HSP-47). Usando questo approccio, 15-20 milioni fibroblasti possono essere derivate in 4-8 settimane per la raccolta di cellule. La dissezione pelle dura circa 15-20 minuti, le cellule vengono poi monitorati una volta al giornosotto il microscopio, e dei media è cambiata ogni 2-3 giorni dopo il sequestro e la conseguenza di cellule.
Protocol
La pelle biopsia ottenuta utilizzando procedura standard 3 (ad esempio ottenuto con 4 millimetri strumento Visipunch rotondo) dovrebbe essere tenuto in completo DMEM 20% FBS media su ghiaccio. Una volta che il campione è arrivato in laboratorio, elaborare la biopsia appena possibile.
1. Preparazione della pelle Punch Biopsia
PASSI 1,1-1,3 DEVONO essere effettuata in un BIOSAFETY ARMADIO
- Preparare in anticipo: Aggiungere 1 ml di 0,1% di gelatina a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Impostare la piastra da parte per 30-60 min. Aspirare la soluzione di gelatina e aggiungere 800 ml di completo DMEM/20% FBS media per ogni bene. Garantire che l'intera superficie del pozzetto è coperto con supporti.
- Invertire il coperchio di un 10 centimetri piatto di coltura tissutale sterili e aggiungere 1,5 ml di DMEM / FBS 20% media al centro del coperchio e diffondere la media di goccia con la punta della pipetta sierologica.
- Utilizzando una pinza sterile, posto tegli pelle biopsia pezzo nei media sul piatto.
2. Dissezione della pelle Punch Biopsia
PASSI 9 2,1-2,2 DEVONO essere effettuata in un ORIZZONTALE cappa a flusso laminare
- Posizionare la porzione di fondo di 10 cm di piatto su coperchio invertita, e trasferire la biopsia al microscopio da dissezione nella cappa a flusso laminare.
- Sezionare una biopsia della pelle tondo 4 mm in 12-15 pezzi di dimensioni uniformi con bordi taglienti per tagliare pezzi in due metà uguali usando un bisturi per tenere la biopsia a posto e la seconda bisturi per tagliare con un moto di rollio in una direzione. Pezzi con bordi frastagliati contribuiscono alla scarsa attaccamento / cella escrescenza.
3. Trasferimento di pelle Dissected Biopsia Pezzi nel tessuto piastre di coltura
PASSI 3,1-3,6 DEVONO essere effettuata in un BIOSAFETY ARMADIO
- Posizionare la parte inferiore del piatto di coltura 10 cm tissutalesulla parte superiore del coperchio invertita, ed il piatto di trasferimento nella all'armadietto biosicurezza.
- Utilizzando una pinza a punta, posto 2-3 biopsia pezzi in ciascun pozzetto della piastra 6-ben preparato contenente 800 ml e non sui pozzi asciutti. Utilizzare maschiatura o scorrevoli movimento per ottenere i pezzi di allegare al fondo del pozzo. Un bisturi è utile per rimuovere eventuali pezzi di biopsia dalle pinze.
- Posizionare la piastra da 6 pozzetti nel 37 ° C incubatore. Monitorare quotidianamente per garantire che vi sia una pellicola di rivestimento supporti fondo del bene per la prima settimana; aggiungere ~ 200 microlitri ogni 2 giorni sostituirà i supporti evaporate.
- Dopo una settimana, aumentare la quantità di supporti a 2 ml di completo DMEM/20% FBS e cambiamento dei media ogni 2-3 giorni.
- Una volta fibroblasti sono confluenti in ciascun pozzetto al punto in cui i fibroblasti stanno raggiungendo i bordi del pozzo, e trypsinize passaggio 6 pozzetti in 2X T75 beute (passaggio 1). I pezzi di tessuto possono essere trasferiti pure. Essi non attaccare ed essere lavato out durante il prossimo cambiamento dei media.
- Una volta che i fibroblasti sono confluenti, trasferirli 3X T175 fiaschi (passaggio 2), congelare in DMEM completo MEDIA Plus 10% DMSO a 1x10 6 cellule / ml per flaconcino.
4. Caratterizzazione dei fibroblasti attraverso Immunostaining
- Fibroblasti cultura in 8 e diapositive da camera rivestite di gelatina.
- Quando le cellule sono al 80% di confluenza, aspirare il terreno da ogni pozzetto.
- Fissare le cellule in 4% paraformaldeide per dieci minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti per 3 volte con PBS 1X.
- Permeabilize le cellule con 150 ml di 0,3% Triton X-100 (in PBS) per 5 min a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti per 3 volte con PBS 1X.
- Aggiungere 200 microlitri soluzione bloccante (PBS + 5% siero di capra normale (Vector, S-1000)) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Preparare una diluizione 1:250 di Anti-Serphin-1 (Anti-coniglio, mAB, Sigma, S5950-200 ml) in soluzione di bloccaggio.
- Aspirate la soluzione di saturazione e aggiungere 150 microlitri della diluizione 1:250 di AntiSERPINH-1. Incubare a 1-2 ore a temperatura ambiente, oppure a 4 ° C durante la notte.
- Lavare i pozzetti per 3 volte con PBS 1X.
- Preparare un anticorpo monoclonale di capra anti-coniglio 1:200 (Alexa Fluor capra anti-IgG di coniglio (H + L), Invitrogen, A11008) nella soluzione di blocco.
- Aggiungere 150 ml di 1:200 anticorpo monoclonale di capra anti-coniglio in ciascun pozzetto. Incubare per 1 ora, al buio, a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti una volta con 1XPBS.
- Aspirare il PBS, e sollevare con cura le camere per rivelare solo la diapositiva.
- Montare il vetrino con 2-3 gocce di mezzo di montaggio contenenti DAPI (Vector, H-1200).
- Analizzare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Cheratinociti crescere senza i pezzi bioptici appena 48 ore dopo la dissezione. Prima fibroblasti escrescenza può essere osservato circa una settimana dopo l'elaborazione. Una volta che i pozzi hanno raggiunto confluenza, i fibroblasti sono diversi passaggi per altri due passaggi per raggiungere tre 150 centimetri palloni (T150) e le cellule vengono crioconservati. Noi generiamo con questo metodo di 15-20 milioni cellule. I fibroblasti sono positivi per anti-SERPINH1 (noto anche come HSP-47) (Figura 1), che è un collagene specifica-chaperone molecolare localizzata nel reticolo endoplasmatico. HSP47 svolge un ruolo essenziale nella biosintesi del collagene nei fibroblasti cutanei (Kuroda, et al, 2004).
Time Line
| Giorno | Aspettativa | ||
| Giorno 3 - Giorno 7 | Attaccamento e conseguenza di cheratinociti | Giorno 7 - Giorno 14 | Conseguenza di fibroblasti |
| Giorno 25 giorni 35 | I fibroblasti dovrebbe coprire il 6 pozzetti e dovrebbero essere per diversi passaggi in 75 centimetri fiaschi, passaggio una seconda volta nel fiaschi 150 centimetri | ||
| Giorno 30-Day 50 | Congelare giù come 1Mio cellule / fiala circa cellule Mio 15-20 in DMEM completo supporto più il 10% di DMSO |
Figura 1. Immunoistochimica Anti-SERPHIN1 di coltura di fibroblasti derivati da pazienti con DAPI di contrasto.
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Discussion
Con questo protocollo, le culture relativamente pure di fibroblasti cutanei possono essere ottenuti. I fibroblasti hanno peculiari caratteristiche morfologiche, corpi cellulari mandrino-come allungate, rotonde a nuclei delle cellule ovali, ed i fibroblasti crescono allineati e in fasci, quando confluenti. I mezzi di comunicazione supporta la crescita dei fibroblasti, mentre altre popolazioni cellulari ad esempio cheratinociti bisogno supplementi e fattori di crescita, o sono mitoticamente meno attivi, ciò permette di colture di fibroblasti relativamente puri.
I fibroblasti sono successivamente diversi passaggi con tripsina in un rapporto di 1:3 a 1:05. La cultura viene ampliata la quantità desiderata di fibroblasti (15-20 milioni) entro 4-8 settimane.
Utilizzando questa tecnica, il nostro laboratorio ha ricavato più di 70 linee di fibroblasti con successo. Abbiamo testato ogni linea per la contaminazione da micoplasma e aggiungere gli antibiotici per i mezzi di crescita per evitare altre contaminazioni batteriche. Per l'icultura espianto nitial abbiamo trovato che il 20% FBS in multimediale supporta la crescita, tuttavia, in seguito passaggi 10% FBS è sufficiente. Occasionalmente, osserviamo una conseguenza diretta di fibroblasti cutanei dai pezzi presumibilmente dovuto l'angolo di taglio della pelle e la rimozione dell'epidermide che contiene cheratinociti.
Una tecnica simile utilizzando un vetrino a tenere premuto i pezzi di pelle è meno efficace nelle nostre mani 4. A causa del movimento del vetrino all'interno della cultura piatto, anche quando maneggiato con cura, i pezzi di pelle non ha attribuito correttamente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo sviluppo di questo protocollo è stato finanziato dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) e Parkinson Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
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References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
