Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Кожа биопсии эксплантата культуры для отвлечения Первичные человеческие фибробласты

doi: 10.3791/3779 Published: July 7, 2013

Summary

Культуре фибробластов эксплант протокол от человека биопсию кожи удар технически надежной и простой способ для получения клеток кожи в течение 4-8 недель для банковской около 15-20 миллионов клеток на низких проход.

Abstract

Тканей и клеточных линий, полученных от индивидуума с заболеваниями являются идеальными источниками для изучения связанных с болезнью сотовых фенотипы. Пациент полученные фибробласты в этом протоколе были успешно использованы при выводе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для модели болезни 1. Ранние проходы этих фибробласты могут также использоваться для основанных на клетках функциональных анализов для изучения конкретных путей заболевание, механизмы 2 и последующие подходы скрининга препаратов. Преимущество представленных протоколов более ферментативной процедуры являются: 1) воспроизводимость техники из небольшого количества тканей, полученных из пожилых пациентов, например пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, 2) технически простым подходом над более сложной методологии использования ферментативного лечения, а также 3 ) время рассмотрения: этот протокол занимает 15-20 минут и может быть выполнена сразу же после прибытия биопсии. Ферментативный лечение может занять до 4 часов, а есть проблемыизбытком, снижение жизнеспособности клеток и последующего прикрепления клеток, когда не обрабатываются должным образом. Этот протокол описывает Вскрытие и подготовка 4-мм человека биопсию кожи для отвлечения культуры фибробластов и имеет очень высокий показатель, что важно при работе с пациентом полученных образцов ткани. В этой культуре, кератиноциты мигрировать из биопсии ткани в течение первой недели после приготовления. Фибробласты появляются через 7-10 дней после первого вырост кератиноцитов. DMEM высокий сред глюкозы с добавлением 20% FBS способствует росту фибробластов на кератиноциты и фибробласты перерасти кератиноцитов. После 2 пассажа кератиноциты были разбавляют что приведет к возможности относительно однородных культур фибробластов выражающая фибробластов маркером SERPINH1 (HSP-47). Используя этот подход, 15-20 млн. фибробласты могут быть получены в течение 4-8 недель для мобильного банкинга. Вскрытие кожи занимает около 15-20 мин, клетки затем контролировать один раз в деньпод микроскопом, и средств массовой информации меняется каждые 2-3 дня после привязанности и нарост клеток.

Protocol

Биопсия кожи получены с использованием стандартных процедур 3 (например, полученные с 4мм круглый инструмент Visipunch) не должны оставаться в полной DMEM СМИ 20% FBS на льду. После того, как образец прибыл в лаборатории, обрабатывать биопсии как можно скорее.

1. Подготовка кожи биопсии

ШАГИ 1.1-1.3 должны быть выполнены по биобезопасности ВНУТРИ ШКАФА

  1. Подготовьте заранее: Добавить 1 мл 0,1% желатина в каждую лунку 6-луночный планшет. Установите пластину в сторону в течение 30-60 мин. Аспирируйте желатинового раствора и добавляют 800 мкл полной DMEM/20% FBS среды в каждую лунку. Убедитесь, что вся поверхность также покрыта информации.
  2. Инверсия крышку стерильный 10 см чашку для культуры ткани и добавляют 1,5 мл DMEM / 20% FBS среды к середине крышки и распространено падения среды с кончиком серологической пипетки.
  3. С помощью стерильного пинцета, место тОн биопсии кожи кусок в средствах массовой информации на блюдо.

2. Рассечение кожи биопсии

Шаги 9 2.1-2.2 должны быть выполнены внутри горизонтальных ламинаре

  1. Поместите нижнюю часть 10 см чашку на перевернутой крышкой, и передают биопсии кожи для рассечения микроскоп в ламинарном боксе.
  2. Проанализируйте 4-мм выстрел биопсии кожи в 12-15 одинакового размера куски с острыми краями, сокращая штук в равные половины с помощью одного скальпеля провести биопсию на месте, а второй скальпелем разрезают качения в одном направлении. Pieces с рваными краями способствуют неправильное прикладывание / Сотовые вырост.

3. Передача расчлененный биопсия кожи части в тканевую культуру,

ШАГИ 3.1-3.6 должны быть выполнены по биобезопасности ВНУТРИ ШКАФА

  1. Поместите нижнюю часть 10 см чашку для культуры тканина вершине перевернутой крышки и передачи обратно в блюдо к шкафу биологической безопасности.
  2. С помощью заостренного щипцов, место 2-3 биопсии части в каждой лунки подготовленных 6-луночный планшет, содержащий 800 мкл и не на сухих скважин. Использование нажав или скользящее движение, чтобы получить части для присоединения к забою скважины. Скальпель полезно удалить биопсию части от щипцов.
  3. Поместите 6-луночный планшет в 37 ° С в инкубаторе. Контролировать ежедневное чтобы у пассажиров было пленкой СМИ покрытием дне колодца в течение первой недели, добавить ~ 200 мкл каждые 2 дня для замены любого выпаривали СМИ.
  4. Через неделю увеличить количество средств массовой информации до 2 мл полной DMEM/20% FBS и изменение среды каждые 2-3 дня.
  5. Как только фибробласты сливающийся в каждой лунке до точки, где фибробластов достигают краев хорошо, Trypsinize и проход 6-луночный планшет в 2X колбах Т75 (проход 1). Кусочки ткани могут быть переданы, а также. Они не придают и стирать Oут во время следующей смены СМИ.
  6. Как только фибробласты сливающиеся, передавать их на 3X колбах Т175 (проход 2), замораживание в полной DMEM СМИ плюс 10% ДМСО при 1x10 6 клеток / мл на флакон.

4. Характеристика Фибробласты через Иммуноокрашивание

  1. Культуры фибробластов в 8 также слайд камере, покрытой желатином.
  2. Когда клетки на 80% слияния, аспирации среды из каждой лунки.
  3. Fix клеток в 4% параформальдегид в течение десяти минут при комнатной температуре.
  4. Промыть лунки 3 раза 1X PBS.
  5. Клетки проницаемыми с 150 мкл 0,3% Тритон Х-100 (в PBS) в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Промыть лунки 3 раза 1X PBS.
  7. Добавить 200 мкл блокирующего раствора (PBS + 5% нормальной козьей сывороткой (Vector, S-1000)) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  8. Подготовить разбавления 1:250 Anti-SERPHIN-1 (Anti-кролика, МАБ, Sigma, S5950-200 мкл) в блокировании решения.
  9. spirate блокирующего раствора и добавляют 150 мкл 1:250 разбавление AntiSERPINH-1. Инкубируют при 1-2 ч при комнатной температуре или при 4 ° С в течение ночи.
  10. Промыть лунки 3 раза 1X PBS.
  11. Подготовьте 1:200 козы против кроличьего моноклонального антитела (Alexa Fluor козы против кроличьего IgG (H + L), Invitrogen, A11008) в блокирующем растворе.
  12. Добавить 150 мкл 1:200 козы против кроличьего моноклонального антитела в каждую лунку. Инкубировать в течение 1 ч, в темном, при комнатной температуре.
  13. Вымойте скважин один раз 1xPBS.
  14. Аспирируйте PBS, и осторожно снимите камеры, чтобы выявить только слайда.
  15. Монтаж салазок с 2-3 капли монтажной средой, содержащей DAPI (Vector, H-1200).
  16. Анализ слайд под флуоресцентным микроскопом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Кератиноциты, растущие из частей биопсии, как только 48 часа после вскрытия. Первый результат фибробластов можно наблюдать около одной недели после обработки. После скважин достигли слияния, фибробласты пассировать в течение еще двух отрывков, достигнет трех колб 150 см (T150) и клетки замораживают. Мы генерировать с помощью этого метода 15-20 миллионов клеток. Фибробласты являются позитивными для анти-SERPINH1 (также известный как HSP-47) (рис. 1), который представляет собой коллаген конкретного молекулярного шаперона локализована в эндоплазматическом ретикулуме. HSP47 играет важную роль в биосинтезе коллагена в коже фибробласты (Курода и др., 2004).

TIME LINE

День Ожидание
День 3 - День 7 Привязанность и следствием кератиноцитов 7 день - День 14 Вырост фибробластов
День 25-35-й день Фибробласты должна охватывать 6-луночный планшет и должно быть для пассировать в колбах 75см, прохождение во второй раз в колбах 150см
День 30-50-й день Заморозить вниз, как 1Mio клеток / флакон около 15-20 Mio клетки в полной DMEM СМИ плюс 10% ДМСО


Рисунок 1. Anti-SERPHIN1 иммуногистохимию пациента полученных культуре фибробластов с контрастного DAPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

С помощью этого протокола относительно чистых культур фибробластов кожи могут быть получены. Фибробласты имеют характерные морфологические особенности удлиненное, веретенообразной клеточных тел, круглой или овальной формы клеточных ядер, и фибробласты растут выровнены и в связках, когда вырожденная. Средства массовой информации поддерживают рост фибробластов в то время как другие, например, клеточные популяции кератиноцитов нужны дополнительные добавки и факторы роста, или митотически менее активны, это дает возможность сравнительно чистых культурах фибробластов.

Фибробласты впоследствии пассировать трипсином в соотношении от 1:3 до 1:5. Культуру расширен до желаемого количества фибробластов (15-20 миллионов) в течение 4-8 недель.

Используя эту технику, наша лаборатория полученных более 70 линий фибробластов успешно. Мы проверили его линию на загрязнение микоплазмой и добавить антибиотики для питательной среды, чтобы избежать других бактериального загрязнения. За Initial культуры эксплантов мы обнаружили, что 20% FBS в средствах массовой информации поддерживает рост, однако, в последующие проходы 10% FBS является достаточной. Иногда мы наблюдаем прямым следствием фибробласты кожи части предположительно из-за угла резания кожи и удаление эпидермиса, который содержит кератиноцитов.

Аналогичная техника использования покровного удерживать кожу частей была менее эффективной в наших руках 4. В связи с перемещением покровного стекла в чашку для культивирования, даже когда с большой осторожностью-коже части не придает должным образом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Развитие этого протокола было профинансировано Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM, TR1-01246) и Паркинсона Альянса.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Leica S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish VWR 25382-166
6-well Tissue Culture plate VWR 73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex VWR 21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes VWR 21008-940
2 mL Serological Pipettes VWR 89130-894
5 mL Serological Pipettes VWR 89130-896
10 mL Serological Pipettes VWR 89130-898
Pasteur Pipettes VWR 14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

1X DMEM: High Glucose Invitrogen/Gibco 11960-069
20% Fetal Bovine Serum Invitrogen/Gibco 26140-079
1X L-Glutamine Invitrogen/Gibco 25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids Invitrogen/Gibco 11140-076
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-163

Table B. Reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
  2. Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
  3. Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
  4. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
  5. Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. 241-246 (2004).
Кожа биопсии эксплантата культуры для отвлечения Первичные человеческие фибробласты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).More

Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter