Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

في هذه الدراسة، فإننا وصف بروتوكول محسن لميكروأري المضاعفة الأجسام المضادة عالية الإنتاجية مع طريقة كشف كتين التي يمكن استخدامها في التنميط ارتباط بالغليكوزيل من بروتينات محددة. يتميز هذا البروتوكول الكواشف موثوق جديدة ويخفف كثيرا من الوقت والتكلفة، ومتطلبات معدات مختبر بالمقارنة مع الإجراء السابق.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. طباعة جسم [ميكروأري] لفحص

  1. تمييع كل الأجسام المضادة إلى 0.5 ملغ / مل في المياه المالحة العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.2 (PBS).
  2. قسامة 40 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة في لوحة مصدر 384 أيضا.
  3. تحميل لوحة مصدر جيد على 384 من Scienion microarrayer sciFLEXARRAYER.
  4. تحميل 20 الشرائح ميكروأري PATH على هذا microarrayer هدفا.
  5. تعيين microarrayer لطباعة 48 subarrays متطابقة، والتي رصدت في 27 الأضداد والبروتينات تحكم في ثلاث نسخ في نمط 9x9 (الشكل 1E، 1F).
  6. بدء microarrayer لطباعة الشرائح [ميكروأري].
  7. جمع الشرائح [ميكروأري]، وتخزينها في كاسيت مع الشرائح المجففة. فراغ ختم كاسيت في كيس من البلاستيك باستخدام فراغ السداده (Foodsaver).
  8. تخزين الشرائح ميكروأري مختومة في 4 درجات مئوية في الثلاجة.

2. كتلة كيميائيا [ميكروأري] لمنع GBPالربط إلى الأجسام المضادة لقطة

الفحص ميكروأري يبدأ مرة يتم حظر كيميائيا الشرائح ميكروأري ويستمر لمدة 8 ساعات تقريبا. بدأت مرة واحدة في فحص ميكروأري ويستكمل (الخطوات من 2 إلى 8).

  1. اتخاذ ميكروأري تنزلق من الثلاجة، ويوازن بينها إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. إزالة الشريحة من مربع التخزين وشطف منهم لفترة وجيزة في درجة الحموضة عازلة فوسفات ملحي 7.2 مع 0.1٪ توين 20 (PBST0.1) مرة واحدة في شريحة حوض الغسيل، ثم في 15 درجة الحموضة الصوديوم ملي العازلة خلات 5.0 مع توين 0.1٪ (CBT0 0.1) بطريقة متسلسلة. احتضان الشرائح في CBT0.1 لمدة 10 دقيقة في حوض الغسيل الشريحة.
  3. إعداد الطازجة 150 مم NaIO 4 في 15 خلات الصوديوم 5.0 مم درجة الحموضة عازلة (CB)، وابقائه في في شريحة غسل حوض في الثلاجة وفي الوقت نفسه تجنب ضوء قبل الاستخدام.
  4. إزالة الشريحة من بناء القدرات، ووضعها في حوض يحتوي على NaIO الطازجة 4 مع الجانب الضدمواجهة. تغطية حوض مع رقائق الألومنيوم لتجنب الضوء، واحتضان حوض الشريحة لمدة 2 ساعة مع لطيف اهتزاز في 4 درجات مئوية في الثلاجة.
  5. تحضير 300 مل من 10 ملي حامض الجلوتاميك هيدرازيد (مانع) في بناء القدرات.
  6. إزالة الشريحة من الحوض، وشطف فترة وجيزة في سي بي 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في حوض الغسيل الشريحة.
  7. احتضان الشرائح في مانع في حوض الغسيل لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
  8. إزالة الشرائح من الحوض، وغسلها مع PBST0.1 لمدة 3 دقائق.

3. منع غير محدد الربط إلى ميكروأري مع ألبومين المصل البقري (BSA)

  1. تحضير 300 مل من 1٪ في جيش صرب البوسنة درجة الحموضة عازلة فوسفات ملحي 7.2 مع توين 0.5٪ (PBST0.5) في حوض الغسيل الشريحة، واحتضان الشريحة ميكروأري في حوض لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع يهز بلطف.
  2. شطف الشرائح في ثلاث مرات PBST0.1 لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  3. وضع الشريحةعلى رف الشريحة، وتدور في 1200 XG على الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة حتى يجف الشريحة ميكروأري.

4. بصمة الشبكة الشمع على الشريحة ميكروأري للفصل بين كل Subarray

  1. قبل تسخين الشمع imprinter في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تحميل الشريحة ميكروأري سدت في imprinter الشمع مع الجانب الأجسام المضادة التي تواجه لشمع. برفق المؤشر إلى شمع بصمة على الشريحة بالتساوي.

5. تطبق عينات المصل على الشريحة ميكروأري

  1. خلال الخطوة 2.4، إعداد عينات مصل الدم إما لفحص التنميط جلكو في عينة واحدة (5.1.1)، أو واحدة قياس epiptope جلكو بين عينات متعددة (5.1.2).
    1. في تجربة لprofilings غليكان من بروتينات سكرية المصل متعددة في عينة واحدة المصل باستخدام متعددة جيجابايت في الثانية (انظر تجربة نموذج 1)، سيتم تطبيق 1 عينات مصل الدم على جميع subarrays. في هذه الحالة، يتم تخفيفه 40 افرة المصل ميكروليتر إلى ميكرولتر 360 من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪توين-20، 0.1٪ بريج 35، 100 ميكروغرام / مل من مفتش الماوس، 100 ميكروغرام / مل من مفتش الفئران، 100 ميكروغرام / مل من مفتش أرنب، 100 ميكروغرام / مل من مفتش الماعز و 100 ميكروغرام / مل من مفتش حمار. هذا الحجم يكفي لتطبيق 6 ميكرولتر من محلول المصل المخفف على كل subarray.
    2. في تجربة لقياس غليكان واحد على بروتينات مصل الدم بين عدة عينات من مصل الدم متعددة باستخدام أحد اكتشافات GBP (انظر تجربة نموذج 2). في هذه الحالة، يتم تخفيفه 1 افرة المصل ميكروليتر إلى 9 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ توين-20، 0.1٪ بريج 35، 100 ميكروغرام / مل من مفتش الماوس، 100 ميكروغرام / مل من مفتش الفئران، 100 ميكروغرام / مل من مفتش أرنب ، 100 ميكروغرام / مل من مفتش الماعز و 100 ميكروغرام / مل من مفتش حمار. هذا الحجم يكفي لتطبيق 6 ميكرولتر من محلول المصل المخفف على كل subarray.
  2. بعد بصمة شمع في الخطوة 4، تطبق بعناية 6 ميكرولتر من عينة المخففة أو عينات التحكم (PBST0.1) إلى كل subarray من الشريحة. احتضان الشريحة في شريط مرطب مع المناشف الورقية الرطب في درجة حرارة الغرفةلمدة 1 ساعة.
  3. شطف الشريحة مع ثلاث مرات PBST0.1 لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  4. تجف الشريحة عن طريق الدوران في 1200 لمدة 2 دقيقة XG.

6. تطبق GBP المعقدة البيروكسيديز (الضد كتين أو مضاد غليكان-) على الشريحة

  1. خلال الخطوة 2.4، إعداد 10μg/ml من يكتينس المعقدة البيروكسيديز / جيجابايت في الثانية في PBST0.1.
    1. في تجربة التنميط غليكان أن مسبار عينة واحدة مع يكتينس متعددة (تجربة نموذج 1)، وإعداد 350 ميكرولتر من كتين المعقدة البيروكسيديز الذي يكفي لجميع subarrays.
    2. في واحد فحص حاتمة / العلامات البيولوجية غليكان في عينات متعددة باستخدام يكتينس متعددة، وإعداد 10 ميكرولتر من كل كتين المعقدة البيروكسيديز الذي يكفي لمدة subarray.
  2. تطبق 6 ميكرولتر من كتين والمعقدة البيروكسيديز المخفف (ق) إلى كل subarray من الشريحة، واحتضان في مربع الشريحة مرطب مع مناشف ورقية مبللة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  3. شطف الشرائح مع ثلاث مرات PBST0.1 لمدة 3 دقائق لكل منظمة الشفافية الدوليةلي.
  4. تجف الشريحة عن طريق الدوران بسرعة 1200 XG في أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة.

7. تطبيق صبغ NeutrAvidin تصنيفها لكشف الإسفار

  1. إعداد 350 ميكرولتر من NeutrAvidin 549 Dylight المسمى الذي يكفي لجميع subarrays.
  2. تطبق 6 ميكرولتر من NeutrAvidin 549 Dylight المسمى على كل subarray، واحتضان الشريحة في كاسيت الشريحة مرطب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  3. شطف الشريحة مع ثلاث مرات PBST0.1 لمدة 3 دقائق في كل مرة.
  4. تجف الشريحة من خلال الدوران في ذلك في 1200 XG في أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة.

8. الحصول على ميكروأري صورة الشريحة عن طريق مسح الشرائح

  1. مسح الشريحة باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري مضان في قرار ميكرون 10. وينبغي ضبط الليزر وPMT تكون قوية بقدر الإمكان، ولكن يتم احترام أي بقعة التشبع.

9. استخراج البيانات وتحليلها

  1. فتح الصورة في ArrayPro 3.2. إعداد قالب مجموعة وفقا لخريطة الصفيف التي تظهر الأجسام المضادة بقع المواقع. محاذاة بعناية كل دائرة قالب على الفور المقابلة في الصورة.
  2. استخراج كثافة من كل بقعة في ملف إكسل لمزيد من التحليل.

10. ممثل النتائج

تجربة نموذج 1

التنميط ارتباط بالغليكوزيل من بروتينات سكرية المصل متعددة في سرطان الكبد المريض عينة مصل الدم باستخدام سدت كيميائيا [ميكروأري] مع كشف يكتينس متعددة.

الهدف من هذه التجربة هو استكشاف الشخصي ارتباط بالغليكوزيل فرد من 20 بروتينات سكرية في سرطان الخلايا الكبدية (HCC) عينة مصل المريض باستخدام سدت كيميائيا [ميكروأري] مع كشف يكتين. وقد تم تصميم جسم [ميكروأري]، الذي يحتوي على 48 subarrays متطابقة التي تضم 26 والأجسام المضادة البيوتين جيش صرب البوسنة، وتصنيعها كما هو موضح في STEP 1. وكانت هذه الأجسام المضادة 26 مقابل 20 في المصل بروتينات سكرية التي حددت بأنها واعدة في وقت مبكر قيمة التشخيص لمرضى سرطان الكبد عن طريق استخدام مناعي مقرها كتين جنبا إلى جنب مع كتلة تحديد بروتين الطيفي 12 و 32 كما هو مبين في الجدول رقم 1. يتم عرض نمط وترتيب جسم البقع طبعت في ثلاث نسخ في subarray ممثل واحد في الشكل و1E 1F، على التوالي. شريحتين ميكروأري متطابقة، كان واحدا لا يتم حظر كيميائيا (الشكل 1A)، في حين كان (الشكل 1B) واحدة أخرى، واستخدمت لتنفيذ التنميط ارتباط بالغليكوزيل نفس التجربة وذلك للتدليل على أهمية إجراء حظر كيميائيا للتحليل. للشريحة حظر كيميائيا (الشكل 1B)، وبدأت التجربة في الخطوة 2، وبالنسبة لشريحة لا شيء سدت كيميائيا (الشكل 1A)، هذه التجربة بدأت من الخطوة 3. وأجريت التجربة من قبل يلي: ·ز جميع الخطوات المذكورة في البروتوكول باستثناء الخطوة 5.1.2 و 6.1.2. في الخطوة 5.2، تم تطبيق نموذج السيطرة على PBST0.1 subarrays في العمود 1 و 3، و تم تطبيق تجميع عينة مصل سرطان الكبد على subarrays في العمود 2 و 4 على التوالي (كما هو موضح في الشكل 1G). هذه المقارنة هو إظهار فعالية وكفاءة من هذا الإجراء، فضلا عن تقارب مستضد ملزم من الأجسام المضادة بعد عرقلة كيميائيا. 22 يكتينس المعقدة البيروكسيديز (كما هو موضح في الجدول رقم 1) التي تم تطبيقها محددة لمختلف glycans 18 و 20 على كل subarray كما هو مبين في الشكل 1G لارتباط بالغليكوزيل التنميط. صور من ميكروأرس (الشكل 1A) منعت كيميائيا (الشكل 1B)، ومنعت غير كيميائيا بعد ارتباط بالغليكوزيل فحص التنميط باتباع بروتوكول. كما هو مبين في subarrays في العمود 1 و 3 في غير كيميائيا ميكروأرس سدت (الشكل 1A و 1C الشكل)، والتيتم تطبيق PBST0.1 فقط، معظم يكتينس ملزمة لالتقاط الاجسام المضادة، وأظهرت أن خلفية عالية جدا مماثلة لتلك التي subarrays في العمود 2 و 4، والتي تم تطبيقها على عينة مصل الدم. فمن المستحيل الحصول على معلومات الملف الشخصي غليكان من هذه الشريحة ميكروأري. على العكس من ذلك، فإن subarrays في العمود 1 و 3، والتي تم تطبيقها فقط PBST0.1 عندما تم إجراء نفس التجربة على شريحة الضد ميكروأري حظر كيميائيا، وأظهرت معظم يكتينس ربط أي أو منخفضة جدا لالتقاط الأجسام المضادة، في حين أن ارتفاع مستضد وقد لوحظت لا يزال الارتباطات في subarrays في العمود 2 و 4، والتي تم تطبيق عينة مصل الدم (1B والشكل 1D). وأظهرت نتيجة هذه الإجراءات حظر كيميائيا كان خطوة حاسمة الصدارة قياس glycans على بروتينات سكرية الضد القبض عليه. وذلك باتباع البروتوكول، يمكن الحصول على ملفات تعريف ارتباط بالغليكوزيل من 22 بروتينات سكرية في مصل سرطان الكبد.

تجربة 2

شاشة لfucos تتغيرylation على بروتينات سكرية المصل محددة المؤشرات الحيوية إلى تشمع الكبد التمييز والمرضى سرطان الكبد.

الهدف من هذه التجربة هو للكشف عن fucosylation تتغير على بروتينات سكرية المصل محددة المؤشرات الحيوية التي تميز تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) من المرضى. تم تطبيق مختلف من التجربة 1، والذي تم تطبيقه فقط عينة واحدة على كل مصل subarrays وبحثها مع يكتينس مختلف، في هذا الاختبار، و 40 مختلف مجموع عينات مصل الدم من سرطان الكبد وتليف الكبد المرضى على كل subarray، وبحثها مع واحد كتين (AAL ). وقد تم التحليل الإحصائي، مثل اختبار T، المتلقي خاصية التشغيل (ROC) منحنى، لتقييم التوزيع أو الأداء التشخيصي للepiptope غليكان / العلامات البيولوجية على كل فرد من البروتين في جميع عينات مصل الدم. استخدمنا [ميكروأري] نفسه تصنيعها في تجربة 1 باستثناء 9-CA19 مكافحة ومضادة للأجسام مضادة لويس العاشر في هذه الدراسة. وexperوقد أجريت iment الخروج من 2 سبتمبر إلى الخطوة 9 باستثناء الخطوة 5.1.1 و 6.1.1. طبقت مجموع 40 عينة مصل الدم في الفترة من 20 تليف الكبد ومرضى سرطان الكبد 20 في subarray عشوائية من subarrays 48 جنبا إلى جنب مع عينات PBS سيطرة على السيطرة السلبية. ثم تم الكشف عن Fucosylation من كل من البروتينات الذي تم القبض عليه عن طريق استخدام المعقدة البيروكسيديز فوكوسي محددة يكتين. أظهرت صورة ميكروأري هو مبين في الشكل (1) وAAL كتين ملزمة فقط للبروتينات مصل القبض على ميكروأري] (الشكل 2D) بدلا من القبض على أجسام مضادة (2E الشكل). ثم انتزعت شدة AAL ملزم من البقع في كل شيء، وتحليلها باستخدام اختبار T ومنحنيات ROC لتقييم أداء fucosylation (كثافة ملزم العال) من كل بروتين مصل على التمييز بين المجلس الأعلى للطفولة ومجموعات تليف الكبد. وأظهرت النتائج أن fucosylation من GP73 بروتين أعطى أفضل التمييز بين المجموعتين مع P = 0.03 و في منطقة تحتمنحنى منحنى ROC يساوي 0،72. أثبتت هذه التجربة هذا الإجراء هو السريع، وسيلة فعالة لفحص حاتمة / العلامات البيولوجية غليكان على عينات متعددة داخل بروتينات متعددة.

معرف اسم كاشف الاختصار شركة كتالوج #
L1 المعقدة البيروكسيديز كونكانافالين A كونا ناقلات مختبرات BK-1000
L2 المعقدة البيروكسيديز كتين خمان؛ بلسان أسود SNA ناقلات مختبرات B-1305
L3 عدسة المعقدة البيروكسيديز Culinaris الملزن LCA ناقلات مختبرات BK-2000
L4 المعقدة البيروكسيديز الخروع COMMUNIS الملزن أنا RCA ناقلات مختبرات BK-1000
L5 المعقدة البيروكسيديز كتين Aleuria برتقالية AAL ناقلات مختبرات B-1395
L6 المعقدة البيروكسيديز كتين الحمرية Cristagalli أطلق بيت التمويل الخليجي ناقلات مختبرات BK-3000
L7 المعقدة البيروكسيديز غريفونيا كتين Simplicifolia (Bandeiraea) الثاني GSL الثاني ناقلات مختبرات BK-3000
L8 المعقدة البيروكسيديز القمح الجرثومي الملزن WGA ناقلات مختبرات BK-1000
L9 المعقدة البيروكسيديز Erythroagglutinin الشائع فاصيلوس PHA-E ناقلات مختبرات BK-2000
L10 المعقدة البيروكسيديز Leucoagglutinin الشائع فاصيلوس PHA-L ناقلات مختبرات BK-2000
L11 الحيويtinylated الفول السوداني الملزن السلطة الوطنية الفلسطينية ناقلات مختبرات BK-1000
L12 المعقدة البيروكسيديز بيسوم Pisum الملزن PSA ناقلات مختبرات BK-2000
L13 المعقدة البيروكسيديز Dolichos Biflorus الملزن DBA ناقلات مختبرات BK-1000
L14 المعقدة البيروكسيديز كتين جوز ماثل DSL ناقلات مختبرات BK-3000
L15 المعقدة البيروكسيديز الصفيراء الملزن تفرضه اليابان SJA ناقلات مختبرات BK-2000
L16 فول الصويا المعقدة البيروكسيديز الملزن SBA ناقلات مختبرات BK-1000
L17 المعقدة البيروكسيديز بطاطس (بطاطا) يكتين المحكمة الخاصة بلبنان ناقلات مختبرات BK-3000 </ TD>
L18 المعقدة البيروكسيديز غريفونيا كتين Simplicifolia (Bandeiraea) أنا GSL أنا ناقلات مختبرات BK-2000
L19 المعقدة البيروكسيديز كتين بيقية Villosa VVL ناقلات مختبرات BK-2000
L20 المعقدة البيروكسيديز اسكولينتوم (الطماطم) يكتين حد الانفجار الأدنى ناقلات مختبرات BK-3000
L21 Ulex المعقدة البيروكسيديز Europaeus الملزن أنا أنا UEA ناقلات مختبرات BK-1000
L22 المعقدة البيروكسيديز Jacalin JACALIN ناقلات مختبرات BK-3000
A1 F عنزة ('أ ب) 2 قطعة مضادة للالغلوبولين المناعي البشري، الأجسام المضادة Fc5μ الغلوبولين المناعي جاكسون المناعي للبحوث 109-006-129
A2 حمار F ('أ ب) 2فرج المضادة للمفتش الإنسان (H + L) الجسم المضاد AB1 جاكسون المناعي للبحوث 709-006-149
A3 الماوس المضادة للمفتش الإنسان F ('أ ب) 2 ريتوكسيماب AB3 جاكسون المناعي للبحوث 209-005-097
A4 الماعز المضادة للجسم البشري ألفا macroglobulin 2 بولكلونل A2M GeneTex GTX62924
A5 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتريبسين الجسم المضاد بولكلونل A1AT لي Biosiences CA1T-80A
A6 الماوس المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتريبسين ريتوكسيماب A1AT سيجما ألدريتش SAB4200198
A7 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتريبسين الجسم المضاد بولكلونل تحرك NeoMarkers RB-367-A1
A8 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتشhymotrypsin الجسم المضاد بولكلونل تحرك فيشر العلمية RB9213R7
A9 جسم الفأر ترانسفيرين المناهضة للبشرية وحيدة النسيلة ترانسفيرين GeneTex GTX101035
A10 أرنب الضد ترانسفيرين المضادة للبشرية بولكلونل ترانسفيرين GeneTex GTX77130
A11 الماعز المضادة للجسم البشري J ئي بولكلونل ApoJ Abcam ab7610
A12 الماوس المضادة للبشرية GP73 ريتوكسيماب GP73 أبوت 14H4-23
A13 الماوس المضادة للبشرية GP73 ريتوكسيماب GP73 سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية المؤتمر الوطني العراقي SC-101275
A14 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1 بروتين جنيني الجسم المضاد بولكلونل ا ف ب GenWay GWB-41C966
A15 الماوس المضادة للبشرية ألفا-1 بروتين جنيني ريتوكسيماب ا ف ب فيتزجيرالد 10-A05A
A16 جسم الفأر هيموبيكسين المناهضة للبشرية وحيدة النسيلة هيموبيكسين Assaypro 60190-05011
A17 الماوس المضادة للبشرية glypican-3 (1G12) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة GPL3 سانتا كروز بيو SC-65443
A18 الماوس المضادة للمولد الكاينين ​​الإنسان (LMW) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مولد الكاينين Assaypro 20333-05011
A19 أرنب المضادة للبشرية MMP-21 ضد وحيد النسيلة MMP21 Epitomic 1955-1
A20 الماوس المضادة للبشرية CEACAM-1 ريتوكسيماب CEACAM R & D أنظمة MAB1180
A21 الفئران المضادة للبشرية DPPIV/CD26 ريتوكسيماب DPPIV R & D أنظمة MAB22441
A22 ماوس لمكافحة الأجسام المضادة البشرية وحيدة النسيلة الثاني PIVKA PIVICA الكريستال الكيميائي 8040
A23 الماوس المضادة للمستضد سرطاني مضغي CEA الولايات المتحدة البيولوجية C1300
A24 مستضد الماوس المضادة للسرطان CA125 CA125 الولايات المتحدة البيولوجية C0050-01D
A25 ماوس لمكافحة السرطان CA19-9 مستضد CA19-9 الولايات المتحدة البيولوجية C0075-18
A26 جسم الفأر X المضادة لللويس وحيدة النسيلة لويس العاشر Calbiochem 434631
الحيوي جيش صرب البوسنة المعقدة البيروكسيديز (مراقبة إيجابية) الحيوي محلية الصنع N / A

الجدول رقم 1. قائمة من الليستين والأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.

اسم المعدات / الكاشف ق شركة فهرس العدد
غير اتصال microarrayer BioDot المؤتمر الوطني العراقي sciFLEXARRAYER
384 microplate الصياد 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
سامسونج النيتروسليلوز coate ميكروأري الشرائح Gentel PATH
الشريحة Imprinter (اختياري) الجل الشركة WSP60-1
شاكر الصياد 15-453-211
نبذ إيبندورف 5804 000.013
حرك غسل حوض / الشرائح تلطيخ واي الصحنال القابل للإزالة الرف الصياد 08-812
الشريحة مربع حضانة الشريحة غرفة / مجهر الصياد 03-448-5
بريج 35، 30٪ حل ث / ت في المياه العضوية Acros AC32958-0025
توين-20 الصياد P337-100
الصوديوم بريودات (NaIO 4) سيغما 311448
L-حمض الغلوتاميك γ-هيدرازيد سيغما G-7257
خلات الصوديوم اللامائية (CH 3 COONa) سيغما S2889
البقري ألبومين المصل (BSA) Lampire مختبرات البيولوجي 7500804
المؤسسة العامة لتحلية الفوسفات عازلة (PBS) (10X) Denville العلمية CP4390-48
Dylight 549 NeutrAvidin مترافق الحرارية 22837
أقراص البروتيني مانع كوكتيل روش 4693159001
ChromPure الإنسان مفتش الحكومة، FC شظية جاكسون Immunoresearch 009-000-008
ChromPure الإنسان مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 009-000-003
ChromPure الفأر مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 015-000-003
ChromPure الفأر مفتش الحكومة، FC شظية جاكسون Immunoresearch 015-000-008
ChromPure أرنب مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 011-000-003
ChromPure حمار مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 017-000-003
[ميكروأري] ماسحة Tecan معاد تحميل LS

الجدول 2. قائمةمن المعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

مخطط 1
مخطط 1 مخطط يبين [ميكروأري] كتين استنادا غليكان عملية اكتشاف العلامات البيولوجية 1 (الخطوة 2 إلى 4): كتلة من [ميكروأري] مع مانع (حمض الغلوتاميك-هيدرازيد) وجيش صرب البوسنة؛ 2 (الخطوة 5):.. تطبيق عينات مصل الدم والقبض على بروتينات سكرية محددة مع أجسام مضادة محددة؛ 3 (الخطوة 6): تطبق كتين المعقدة البيروكسيديز (ق)، 4 (الخطوة 7): دقق في AAL المعقدة البيروكسيديز مع NeutrAvidin 549 Dylight المسمى للتصوير ميكروأري.

الشكل 1
الشكل 1. الصور ميكروأري من التنميط تجربة عينة ارتباط بالغليكوزيل 1 من بروتينات سكرية متعددة في عينة مصل المريض مصل سرطان الكبد عن طريق استخدام كيميائيمنعت حليف [ميكروأري] مع كشف كتين متعددة. شريحتين ميكروأري متطابقة، (A) لا شيء سدت كيميائيا، أو (ب) منع كيميائيا كما هو موضح في الخطوة 2، على حد سواء ذهب من خلال جميع الخطوات 2-9 لتحديد ملامح ارتباط بالغليكوزيل، فضلا عن غرض المقارنة. (أ) و (ب) هي الصور ميكروأري فحصها في الخطوة 8 في قرار من 10 ميكرون. (ج) والتكبير في صورة صفين الأول من أي حظر كيميائيا ميكروأري الشريحة (أ)، (د) التكبير في صورة صفين الأول من الشريحة غير ميكروأري حظر كيميائيا (B))، (ه) الرسم البياني للترتيب الأجسام المضادة داخل كل subarray؛) و (خرائط الصفيف: موقع كل الأجسام المضادة داخل subarray، كل اسم الضد يمثل حوالي 3 نقاط، (ز) عينة مصل والموقع كتين: 1 يوضح الرسم البياني الذي subarray كل عينة مصل الدم و وقد طبقت على يكتين.

الشكل 2
الشكل 2. الصور ميكروأري للعينة تجربة 2 الشاشة لfucosylation تتغير على بروتينات سكرية المصل محددة المؤشرات الحيوية التي تميز تليف الكبد ومرضى سرطان الكبد. وأجري الفحص ميكروأري خارج كما هو موضح في القسم عينة 2 تجربة. (أ) صورة الشريحة كاملة من الشريحة ميكروأري من الخطوة 8، (ب) الرسم التخطيطي لترتيب الأجسام المضادة داخل كل subarray، (ج) خرائط الصفيف: موقع كل الأجسام المضادة داخل subarray، كل اسم الضد يمثل حوالي 3 نقاط؛ (د) والتكبير في صورة subarray التي تم تحضين مع عينة مصل، (ه) التكبير في صورة subarray التي تم تحضين مع مراقبة برنامج تلفزيوني.

الشكل (3)
الشكل 3. نتائج التنميط غليكان من تجربة نموذج 1. كل رسم بياني شريطي يمثل الشخصية ملزم كتين (أو ملامح غليكان) واحد من البروتين 20 المختبرة. واستخدمت الكلي 22 يكتينس مختلفة لتحليل اله غليكان الشخصي من كل من البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. بروتين الهدف والتقاط اختيار الأضداد

قبل فحص الجسم المضاد ميكروأري، وهناك حاجة إلى بعض الكواشف والمواد التي سينظر فيها، وأعد. وينبغي لتصميم جسم [ميكروأري] لتحديد ملامح غليكان أو غليكان فحص العلامات البيولوجية، وفريق من الاجسام المضادة المحددة للمرشحين بروتين سكري يتم تحديدها وفقا للأدب أو من النتائج السابقة. تم شراؤها عادة هذه الأجسام المضادة من مختلف البائعين، مثل البحث والتطوير الجماعات الحكومية الدولية وما إلى ذلك أنظمة ويفضل التقاط الأجسام المضادة منذ تجاربنا السابقة اظهرت ان بعض الغلوبولين المناعي وفريق الخبراء الحكومي الدولي قد يفقد تماما الانتماءات مستضد ملزم لهم بعد تعديل المادة الكيميائية.

2. تصميم وتصنيع جسم [ميكروأري]

تصنيع جسم [ميكروأري] خطوة اختيارية، الذي يحتاج microarrayer المهنية ومكلفة، وموظفين مدربين جيدا للعمل. ومع ذلك، حسب الطلب جسم [ميكروأري الشركة المنتجةويمكن القيام به بسهولة تلح من مزود الخدمة مثل Serome العلوم البيولوجية المحدودة للحصول على نتيجة قوية، نوصي microarrayer عدم الاتصال، مثل حجم sciFLEXARRAYER جدا Scienion منخفض عدم الاتصال microarrayer الذي كان يستخدم في تصنيع الأجسام المضادة لدينا [ميكروأري]. ارتفاع قدرة ميكروأري ملزم الشرائح، مثل المسار (Gentel شركة بيو ويسكونسن) أو H الشرائح (Shott، والسلطة الفلسطينية).

3. اختيار وإعداد البروتينات ملزمة غليكان (جيجا بت في الثانية) لتحديد ملامح ارتباط بالغليكوزيل

جيجابايت في الثانية التي تستهدف مختلف أحادية أو يمكن العثور على يغوساكاريدس في الأدب ومن خلال محرك البحث الذي وضعه مختبر هاب 29 و حافظت في معهد الجينوم بالحركة لتحديد جيجابت في الثانية مع خصوصية عالية وتقارب إلىوالحواتم غليكان المستهدفة، حدد عزر (حاتمة) من القائمة المنسدلة، وانقر على "بحث". سيتم سرد محددة جيجابايت في الثانية لهذا عزر (حاتمة) وفقا لقيمة logP بهم من الأعلى إلى النظام منخفضة. أعلى logP يشير إلى وجود تقارب أقوى ملزمة وخصوصية لعزر غليكان / حاتمة. بسبب هذه القضية غير محددة ملزمة من ملازم كتين، وهذه الطريقة لا تزال غير مثالية مثل فحص الجسم المضاد القائم. وبالتالي، فإننا نوصي بشدة أن تستخدم الأجسام المضادة المقاومة للغليكان، مثل لويس لمكافحة x أو المضادة للsialyl لويس الأضداد، إذا كانت متوفرة. استخدام جيجابايت في الثانية متعددة للكشف عن آخر هو استراتيجية لعبور تحقق ملزم ملامح مختلفة، والحصول على بيانات موثوقة ملزم.

4. تحليل البيانات

لأنه يتم استخدام هذه الطريقة للكشف عن بروتينات مصل الدم الأصلي، قد يتم القبض على البروتين بروتين المجمعات والكشف عنها. لطخة غربية أو قياس الطيف الكتلي هو طرق جيدة للتحقق من صحة البيانات ميكروأري]. في هذه الأثناء، والكشف عن مستويات البروتين باستخدام ميكروأري نفسه هو طريقة أخرى لمعرفة تفاصيل عن تغيير ارتباط بالغليكوزيل من البروتين، مثل ما إذا كانت التغييرات هي نتيجة لتغير مستوى البروتين الكلي أو مجرد أن مستوى ارتباط بالغليكوزيل المتزايد على كل من البروتينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل معهد أبحاث التهاب الكبد الوبائي وفيروس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter