Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kemisk blokeret antistof Microarray for Multiplexed Højkapacitetsforskning Profilering af specifikke protein Glycosylering i komplekse prøver

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi en forbedret protokol til et multiplekset high-throughput-antistof mikroarray med lectin påvisningsmetode, der kan anvendes i glycosylering profilering af specifikke proteiner. Denne protokol indeholder nye pålidelige reagenser og reducerer den tid, omkostninger og lab krav til udstyr i forhold til den tidligere procedure.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Udskrive en Antistof Microarray for assayet

  1. Fortyndes alle antistoffer til 0,5 mg / ml i phosphatbufret saltvand, pH 7,2 (PBS).
  2. Portion 40 ul af hvert antistof i 384-brønds kilde plade.
  3. Læg 384-brønds source plade på Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
  4. Læg 20 PATH microarray glider på microarrayer som mål.
  5. Indstille microarrayer at udskrive 48 identiske subarrays, hvor 27-antistoffer og kontrol proteiner plettede in triplo i en 9x9 mønster (fig. 1E, 1F).
  6. Start microarrayer at udskrive de antistof microarray dias.
  7. Saml antistof microarray dias, og gemme dem i dias kassette med tørremiddel. Vakuumtætning kassetten i en plastpose ved hjælp vakuum sealer (Foodsaver).
  8. Lagring af de forseglede microarray objektglas ved 4 ° C i køleskab.

2. Kemisk Bloker Antibody Microarray til forebyggelse GBPBinde til indfangnings-antistoffer

Den microarray-analysen starter, når microarray dias er kemisk blokeret og varer cirka 8 timer. Når startede microarray-analysen er afsluttet (trin 2 til 8).

  1. Tage mikroarray glider ud af køleskabet, og ækvilibrering dem til stuetemperatur i 30 minutter.
  2. Fjerne objektglasset fra opbevaringskassen og kortvarigt skyl dem i phosphatpuffersaltopløsning pH 7,2 med 0,1% Tween 20 (PBST0.1) en gang i et objektglas håndvask, og derefter i 15 mM natriumacetatpuffer pH 5,0 med 0,1% Tween (CBT0 0,1) i en sekventiel måde. Inkubér objektglassene i CBT0.1 i 10 minutter i slide håndvask.
  3. Forbered frisk 150 mM NaIO 4 i 15 mM natriumacetat pH 5,0 (CB), og holde den i ind i et dias håndvask i et køleskab og samtidig undgå lys før brug.
  4. Fjern dias fra CB, og sætte det ind i bassinet med frisk NaIO 4 med antistoffet sideopad. Omfatte vask med aluminiumfolie for at undgå lys, og inkuber glideren bassinet i 2 timer under forsigtig omrystning ved 4 ° C i et køleskab.
  5. Fremstille 300 ml af 10 mM hydrazid glutaminsyre (blokerings) i CB.
  6. Fjern dias fra bassinet, og kort skyl den i CB 3 gange i 5 minutter hver gang i slide håndvask.
  7. Glassene inkuberes i blokker i en håndvask i 2 timer ved stuetemperatur med forsigtig rystning.
  8. Fjern dias fra bassinet, og vask dem med PBST0.1 i 3 minutter.

3. Blokere ikke-specifikke bindinger på mikroarrayet med bovint serumalbumin (BSA)

  1. Fremstille 300 ml af 1% BSA i phosphatbuffer saltvand, pH 7,2 med 0,5% Tween (PBST0.5) i et objektglas håndvask, og inkuber mikroarrayet objektglasset i bassinet i 1 time ved stuetemperatur med forsigtig omrystning.
  2. Skyl objektglassene i PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
  3. Sæt slidepå et objektglas stativ, og centrifugering ved 1200 xg i en centrifugering i 2 minutter for at tørre den mikroarray objektglasset.

4. Imprint Wax Grid på Microarray Slide at adskille de enkelte undergrupperingen

  1. Forvarmning af voks imprinter ved 70 ° C i 5 minutter.
  2. Læg den blokerede microarray glide ind i voks imprinter med antistof opad til voks. Træk forsigtigt i håndtaget til aftryk voks på slide jævnt.

5. Anvendelse Serumprøver på mikroarrayet Slide

  1. Under Trin 2,4, forberede serumprøver for enten Glyco profilering analysen i en prøve (5.1.1), eller en enkelt Glyco epiptope måling blandt flere prøver (5.1.2).
    1. I et eksperiment for glycan profileringer af multiple serumglycoproteiner i en serumprøve ved hjælp af flere Euros (se eksempel eksperiment 1), vil et serumprøver påføres på alle subarrays. I dette tilfælde er 40 pi serum rigelig fortyndet i 360 ul PBS indeholdende 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml muse IgG, 100 ug / ml rotte IgG, 100 ug / ml kanin-IgG, 100 ug / ml gede-IgG og 100 ug / ml æsel IgG. Denne mængde er tilstrækkelig til at anvende 6 ul fortyndet serum opløsningen på hver undergrupperingen.
    2. I et eksperiment for den glycan måling af flere serumproteiner mellem flere serumprøver ved anvendelse af en GBP detektioner (se eksempel eksperiment 2). I dette tilfælde er en pi serum rigelig fortyndet i 9 pi PBS indeholdende 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml muse IgG, 100 ug / ml rotte IgG, 100 ug / ml kanin-IgG , 100 ug / ml gede-IgG og 100 ug / ml æsel IgG. Denne mængde er tilstrækkelig til at anvende 6 pi fortyndet serum opløsningen på hver undergrupperingen.
  2. Efter voks aftryk i trin 4, omhyggeligt gælder 6 pi fortyndet prøve eller kontrolprøver (PBST0.1) til hver undergruppering af dias. Inkuber slæden i en fugtig kassette med våde papirhåndklæder ved stuetemperaturi 1 time.
  3. Skyl objektglasset med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
  4. Tør dias ved spinding den ved 1200 xg i 2 minutter.

6. Anvend Biotinyleret GBP (Lectin eller Anti-glycan antistof) på Slide

  1. Under trin 2.4, forbereder 10μg/ml af biotinylerede lectiner / Gbps i PBST0.1.
    1. I glycan profilering eksperiment som probe én prøve med flere lectiner (prøve eksperiment 1), fremstilling 350 uL af biotinyleret lectin, som er tilstrækkelig for alle subarrays.
    2. I én glycan epitop / biomarkør screening i multiple prøver ved hjælp af flere lectiner, fremstilles 10 ul af hver biotinyleret lectin, som er tilstrækkelig for en undergruppering.
  2. Anvendelse 6 pi af fortyndet biotinyleret lectin (er) til hver undergrupperingen af ​​slæden, og inkubér i befugtet objektglasset kassen med våde papirhåndklæder ved stuetemperatur i 1 time.
  3. Skyl objektglassene med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver Timig.
  4. Tør objektglasset ved centrifugering den ved 1200 xg i centrifuge for 2 minutter.

7. Anvendelse farvestofmærkede NeutrAvidin til fluorescenspåvisning

  1. Forberede 350 pi Dylight 549 mærket NeutrAvidin som er tilstrækkelig for alle subarrays.
  2. Anvendelse 6 pi Dylight 549 mærket NeutrAvidin på hver undergrupperingen og inkuber glideren i befugtet objektglasset kassetten ved stuetemperatur i 1 time.
  3. Skyl objektglasset med PBST0.1 tre gange i 3 minutter hver gang.
  4. Tør dias ved at dreje den ved 1200 xg i centrifuge i 2 minutter.

8. Få Microarray Slide billede ved at skanne Slide

  1. Scan dias ved hjælp af en fluorescens microarray scanner på 10 um opløsning. De laser-og PMT-indstillinger skal være så stærk som muligt, men ingen mætning stedet observeres.

9. Dataudtræk og analyse

  1. Åbn billedet i ArrayPro 3,2. Nedsat arrayet skabelonen ifølge arrayet kort, der viser antistof-spots steder. Omhyggeligt tilpasse hver skabelon cirkel på den tilsvarende sted i billedet.
  2. Uddrag intensiteten af ​​hver plet i en Excel-fil til yderligere analyse.

10. Repræsentative resultater

Prøven Eksperiment 1

Glykosylering profilering af flere serumglycoproteiner i hepatocellulært carcinom patientserum prøve ved hjælp af kemisk blokeret antistof microarray med flere lektiner detektion.

Formålet med dette eksperiment er at undersøge den individuelle glycosylering profil 20 glycoproteiner i hepatocellulært carcinom (HCC) patientserum prøve ved anvendelse af kemisk blokeret antistof mikroarray med lectin detektion. Et antistof microarray, der indeholder 48 identiske subarrays, som omfatter 26 antistoffer og biotin-BSA, er designet og fremstillet som beskrevet i STEP 1. Disse 26 antistoffer var mod 20 serumglycoproteiner, der er identificeret som lovende tidlig diagnose værdi for HCC patienter ved hjælp af lectin-baseret immunopræcipitation kombineret med massespektrometrisk proteinidentifikation 12, 32 som vist i tabel 1. Mønsteret og arrangementet af de antistof pletter trykkes in triplo i et repræsentativt undergrupperingen er vist i Figur 1E og 1F, hhv. To identiske microarray objektglas, én var ikke kemisk blokeret (fig. 1A), mens den anden blev (figur 1B), blev anvendt til at udføre den samme glycosylering profilering eksperiment for at påvise betydningen af kemisk blokering procedure til analyse. For kemisk blokeret slæde (figur 1B), begyndte eksperimentet ved trin 2, for ingen kemisk blokeret slæde (figur 1A), begyndte eksperimentet fra trin 3. Eksperimentet blev udført ved following alle de skridt, der er beskrevet i protokollen, bortset fra trin 5.1.2 og 6.1.2. I trin 5.2 blev en PBST0.1 kontrolprøve påført subarrays i kolonne 1 og 3, og en samlet HCC serumprøve blev påført subarrays i kolonne 2 og 4, henholdsvis (som vist i figur 1G). Denne sammenligning er at vise effektiviteten af ​​fremgangsmåden, samt antigenbindingsaffinitet af antistofferne efter kemisk blokering. 22 biotinylerede lectiner (som vist i tabel 1), der er specifikke for forskellige glycaner 18, 20 blev anvendt på hver undergrupperingen som vist i figur 1G for glycosylering profilering. Billeder af de kemisk blokeret (fig. 1B) og ikke-kemisk blokeret (fig. 1A) microarrays efter glycosylering-profileringsassay ved at følge protokollen. Som vist i subarrays i kolonne 1 og 3 i ikke-kemisk blokeret mikroarrays (figur 1A og figur 1C), somKun PBST0.1 blev anvendt fleste lectiner bundet til indfangnings-antistoffer og viste meget høj baggrund, der kan sammenlignes med dem subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøven blev anvendt. Det er umuligt at få glycan profil oplysninger fra dette microarray dias. Tværtimod, når det samme forsøg blev udført på en kemisk blokeret antistof mikroarray glider de subarrays i kolonne 1 og 3, som kun PBST0.1 blev anvendt fleste lectiner udviste ingen eller meget lav bindinger at indfange antistoffer, mens høj-antigen bindinger blev stadig observeret i subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøven blev påført (fig. 1B og 1D). Disse Resultatet viste, at kemisk blokering af proceduren var et afgørende skridt forgrunden måling af glycaner på antistof-tilfangetagne glycoproteiner. Ved at følge protokollen, kan glycosylation profiler af 22 glycoproteiner i HCC serum opnås.

Eksperiment 2

Skærm for ændrede fucosylation på specifikke serumglycoproteiner som biomarkører til diskrimineret levercirrose og hepatocellulært carcinom patienter.

Målet med dette eksperiment er at screene for ændret fucosylering om bestemte serumglycoproteiner som biomarkører, som diskriminerer levercirrose og hepatocellulært carcinom (HCC) patienter. Forskellig fra eksperiment 1, hvori kun én serumprøve blev anbragt på hver subarrays og probet med forskellige lektiner, i dette assay, i alt 40 forskellige serumprøver fra HCC og cirrhose patienter blev påført hver undergrupperingen og probet med et lectin (AAL ). Statistisk analyse, såsom T-test, modtager-operating characteristic (ROC) kurve, blev udført for at evaluere fordelingerne eller diagnostisk ydeevne glycan epiptope / biomarkør for hvert enkelt protein i alle serumprøver. Vi anvendte det samme antistof mikroarray fremstillet i forsøg 1, bortset fra anti-CA19-9-og anti-Lewis X-antistoffer i denne undersøgelse. Den ekspertiseiment blev gennemført fra september 2 til trin 9 med undtagelse af Step 5.1.1 og 6.1.1. I alt 40 serumprøver fra 20 skrumpelever og 20 HCC patienter blev anvendt tilfældigt undergrupperingen af ​​de 48 subarrays sammen med de kontrol PBS prøver som negativ kontrol. Fucosylering af hver af de indfangede proteiner blev derefter detekteret ved hjælp af biotinyleret Fucose-specifik lectin. Mikroarrayet billede vist i figur 1 viste lectin AAL kun bundet til serumproteiner fanget på mikroarrayet (fig. 2D) i stedet for indfangede antistoffer (figur 2E). AAL bindende intensiteter af alle de steder blev derefter ekstraheret, og analyseres ved hjælp af T-test og ROC kurver at evaluere resultaterne af fucosylering (AAL binding intensitet) af hvert serum protein på forskelsbehandling mellem HCC og skrumpelever grupper. Resultaterne viste, at fucosylering af GP73 protein gav den bedste forskelsbehandling mellem de to grupper med en p = 0,03 og areal-under-kurve ROC-kurven er lig med 0,72. Dette eksperiment viste denne fremgangsmåde er en hurtig, effektiv fremgangsmåde til glycan epitop / biomarkør screening af flere prøver i adskillige proteiner.

ID Navn på reagenset Forkortelse Firma Katalog #
L1 Biotinyleret Concanavalin A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinyleret Sambucus nigra Lectin SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinyleret Lens culinaris agglutinin LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinyleret Ricinus communis agglutinin I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinyleret Aleuria Aurantia Lectin AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinyleret Erythrina Cristagalli Lectin ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinyleret Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinyleret hvedekimagglutinin WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Biotinyleret Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Biotinyleret Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Biotinylated jordnøddeagglutinin PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinyleret Pisum sativum agglutinin PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinyleret Dolichos Biflorus agglutinin DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Biotinyleret Datura stramonium Lectin DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinyleret Sophora Japonica agglutinin SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Biotinyleret Soybean agglutinin SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinyleret Solanum tuberosum (Kartoffel) Lectin STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Biotinyleret Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lectin I GSL jeg Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinyleret Vicia villosa Lectin VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinyleret Lycopersicon esculentum (Tomat) Lectin LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Biotinyleret Ulex Europaeus agglutinin jeg UEA jeg Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinyleret brødfrugt Brødfrugt Vector Laboratories BK-3000
A1 Ged F (ab ') 2 fragment-anti-humant IgM, Fc5μ antistof IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Æsel F (ab ') 2Frag-anti-humant IgG (H + L)-antistof AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Muse anti-human IgG F (ab ') 2 monoklonalt antistof ÆB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Gede-anti-humant alpha 2 macroglobulin polyklonalt antistof A2m GeneTex GTX62924
A5 Kanin-anti-humant alpha-1-antitrypsin-polyklonalt antistof A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Muse anti-human alpha-1-antitrypsin-monoklonalt antistof A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Kanin-anti-humant alpha-1-antitrypsin-polyklonalt antistof ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 Kanin-anti-humant alpha-1-antichymotrypsin polyklonalt antistof ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Muse anti-human transferrin monoklonalt antistof Transferrin GeneTex GTX101035
A10 Kanin-anti-humant transferrin polyklonalt antistof Transferrin GeneTex GTX77130
A11 Gede-anti-humant apolipoprotein J polyklonalt antistof ApoJ Abcam ab7610
A12 Muse anti-human GP73 monoklonalt antistof GP73 Abbott 14H4-23
A13 Muse anti-human GP73 monoklonalt antistof GP73 Santa Cruz Biotechnology INC sc-101.275
A14 Kanin-anti-humant alpha-føtoprotein en polyklonalt antistof AFP GenWay GWB-41C966
A15 Muse anti-human alpha-1 føtoprotein monoklonalt antistof AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Muse anti-human hæmopexin monoklonalt antistof Hæmopexin Assaypro 60190-05011
A17 Muse anti-human glypican-3 (1G12) monoklonalt antistof GPL3 Santa Cruz Bio sc-65.443
A18 Muse anti-human kininogen (LMW) monoklonalt antistof Kininogen Assaypro 20333-05011
A19 Kanin-anti-human MMP-21 monoklonalt antistof MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Muse anti-human CEACAM-1 monoklonalt antistof CEACAM R & D Systems MAB1180
En21 Rotte-anti-humant DPPIV/CD26 monoklonalt antistof DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Muse anti-human Pivka II monoklonalt antistof PIVICA Crystal kemi 8040
A23 Muse anti-carcinoembryonisk antigen CEA USA biologiske C1300
A24 Muse-anti-CA125 cancerantigen CA125 USA biologiske C0050-01D
A25 Muse-anti-CA19-9 cancerantigen CA19-9 USA biologiske C0075-18
A26 Muse-anti-Lewis X-monoklonalt antistof Lewis X Calbiochem 434631
bio Biotinyleret BSA (positiv kontrol) Bio Hjem-made N / A

Tabel 1. Liste over lectiner og antistoffer, der anvendes i denne protokol.

Reagensets navn, s / udstyr Firma Katalog nummer
Ikke kontakt microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 mikrotiterplade Fisher 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultratynde nitrocellulose coate microarray glider Gentel PATH
Slide Imprinter (valgfrit) Gelen Company WSP60-1
Shaker Fisher 15-453-211
Centrifuger Eppendorf 5804 000.013
Skub håndvask / Slide farvning Dish with Aftagelig Rack Fisher 08-812
Objektglas rugekammeret / mikroskoppræparatglas box Fisher 03-448-5
Brij 35, 30% w / v opløsning i vand Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher P337-100
Natriumperiodat (NalO4) Sigma 311448
L-glutaminsyre γ-hydrazid Sigma G-7257
Natriumacetat Vandfri (CH3COONa) Sigma S2889
Bovint serumalbumin (BSA) Lampire Biologisk Labs 7500804
Phosphatpuffersaltopløsning (PBS) (10X) Denville Videnskabelige CP4390-48
Dylight 549 konjugeret NeutrAvidin Thermo 22837
Proteaseinhibitor-cocktail Tabletter Roche 4693159001
ChromPure Humant IgG, Fc-fragmentet Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure Humant IgG, helt molekyle Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure mus IgG, helt molekyle Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure mus IgG, Fc-fragmentet Jackson Immunoresearch 015-000-008
ChromPure kanin IgG, helt molekyle Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, helt molekyle Jackson Immunoresearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabel 2 nedenfor. Listaf udstyr og reagenser, der anvendes i denne protokol.

Skema 1
Skema 1 En ordning viser lectin antistoffet mikroarray baseret glycan biomarkør opdagelse fremgangsmåde 1 (Trin 2 til 4): Blokering af antistoffet mikroarray med blokker (Glu-hydrazid) og BSA, 2 (trin 5).. Anvendelse serumprøver og indfange specifikke glycoproteiner med specifikke antistoffer, 3 (Trin 6): anvendelse biotinyleret lectin (er), 4 (trin 7): Probe det biotinylerede AAL med Dylight 549 mærket NeutrAvidin for mikroarray billeddannelse.

Figur 1
Figur 1. Microarray billeder af prøven Eksperiment 1 glycosylering profilering af multiple serumglycoproteiner i HCC patient serumprøve ved hjælp chemicallierede blokeret antistof mikroarray med multiple lectin detektion. To identiske microarray objektglas (A) ingen kemisk blokeret eller (B) kemisk blokeret som beskrevet i trin 2, begge gik gennem alle trin fra 2 til 9 til glycosylering profilering samt sammenligningsformål. (A) og (B) er microarray billederne scannes på trin 8 i en opløsning på 10 mikron. (C) zoom i billedet af de to første rækker af ingen kemisk blokeret microarray slide (A), (D) zoom i billedet af de to første rækker ikke kemisk blokeret microarray slide (B)), (E) diagrammet af antistoffet arrangementet i hvert undergrupperingen (f) array kort: placeringen af ​​hvert antistof i undergrupperingen, hvert antistof navn repræsenterer 3 pletter (G) serumprøve og lectin placering: Et diagram viser, hvilke undergrupperingen hver serumprøve og lectin blev påført på.

Figur 2
Figur 2. Microarray billeder afPrøven eksperiment 2 skærm til ændret fucosylering om bestemte serumglycoproteiner som biomarkører, som diskriminerer levercirrose og HCC patienter. Mikroarrayet Assayet blev udført som beskrevet i Eksempel Eksperiment 2 sektion. (A) Hele lysbillede af mikroarray objektglasset fra trin 8 (B) diagram af antistoffet arrangementet i hvert undergrupperingen, (C) array-kort: placeringen af ​​hvert antistof i undergrupperingen, hvert antistof navn repræsenterer 3 pletter; (D) en zoom-in billede af en undergruppering der blev inkuberet med serum-prøve (E) en zoom-in billede af en undergruppering der blev inkuberet med PBS-kontrol.

Figur 3
Figur 3. Glycan profilanalyser fra prøven eksperiment 1. Hver søjlegraf repræsenterer lectin binding profil (eller glycan profiler) ifølge et af de 20 testede protein. Alt 22 forskellige lectiner blev benyttet til at analysere the glycan profil af hvert protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Target protein og capture Antibody Selection

Forud for antistoffet mikroarray assayet nogle reagenser og materialer for at blive betragtet og fremstilles. At designe et antistof microarray for glycan profilering eller glycan biomarkør screening, et panel af antistoffer specifikke for glycoprotein ansøgere skal fastlægges i henhold til litteraturen eller fra tidligere resultater. Disse antistoffer var normalt købt fra forskellige leverandører, såsom R & D Systems mv IgG foretrækkes indfangningsantistoffer forhold til vores tidligere tests viste, at nogle IgM og IgE helt kan miste deres antigen bindingsaffiniteter efter kemisk modifikation.

2. Design og fremstilling af antistof microarray

Fremstilling af antistoffet microarray er et valgfrit trin, som kræver professionel og dyre microarrayer, og vel-uddannet personale til drift. Men tilpasset antistof microarray fremstiltur kan let udføres fra en tjenesteudbyder, såsom Serome Biosciences Inc. For en robust resultat, anbefales en berøringsfri microarrayer, såsom Scienion sciFLEXARRAYER ultralav volumen berøringsfri microarrayer der blev anvendt i vores antistof mikroarray fremstilling. Høj bindingskapacitet microarray lysbilleder, såsom PATH (Gentel Bio Inc. WI) eller Slide H (Shott, PA).

3. Vælg og Forbered glycan proteiner (Gbps) for glycosylering profilering

Euros målet forskellige mono-eller oligosaccharider kan findes i litteraturen og gennem en søgemaskine udviklet af Haab laboratoriet 29 og holdes på det translationelle Genomics Institute At vælge Euros med høj specificitet og affinitet tilde målrettede glycan epitoper, vælge motiv (epitop) fra drop down menuen, og klik på "søg". Den Euros specifikke for dette motiv (epitop) vil blive opført i henhold til deres logP værdi fra høj til lav orden. Højere logP angiver en stærkere bindingsaffinitet og specificitet til glycan motiv / epitop. Grund af den iboende ikke-specifik binding emne fra lectin, er denne fremgangsmåde stadig ikke så optimalt som antistoffet assay. Derfor anbefaler vi, at anti-glycan antistoffer anvendes, såsom anti-Lewis X eller anti-sialyl Lewis nogle antistoffer, hvis de er tilgængelige. Anvendelse af flere Euros for detektion er en anden strategi til at krydstjekke forskellige bindende profiler og for at få pålidelige bindende data.

4. Dataanalyse

Fordi denne fremgangsmåde anvendes til at detektere native serumproteiner, kan protein-protein-komplekser kan indfanges og detekteres. Western blot eller massespektrometri er gode metoder at validere microarray data. I mellemtiden, Detektion af protein-niveauer ved hjælp af samme mikroarray er en anden metode til at lære detaljerne i glycosylering ændring af proteinet, såsom hvorvidt ændringer var på grund af det totale proteinindhold ændring eller blot at glycosylering niveau forøges på hver af proteinerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Institut for hepatitis og Virus Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Kemisk blokeret antistof Microarray for Multiplexed Højkapacitetsforskning Profilering af specifikke protein Glycosylering i komplekse prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter