Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kemiskt blockerad antikropp Microarray för Multiplexade hög kapacitet profilering av specifik proteinglykosylering i komplexa prover

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

I denna studie beskriver vi ett förbättrat protokoll för en multiplexerad med hög genomströmning antikropp mikromatris med lektin detektionsmetod som kan användas i glykosylering profilering av specifika proteiner. Detta protokoll innehåller nya tillförlitliga reagenser och avsevärt minskar den tid, kostnad och lab krav på utrustning jämfört med föregående procedur.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Skriv en antikropp Microarray för analysen

  1. Späd alla antikroppar till 0,5 mg / ml i fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,2 (PBS).
  2. Alikvot 40 | il av varje antikropp i den 384-brunnars platta källa.
  3. Ladda 384-brunnars källa plattan på Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
  4. Ladda 20 bilder PATH microarray på microarrayer som mål.
  5. Ställ microarrayer att skriva ut 48 identiska subsystem, där 27 antikroppar och proteiner kontroll är fläckig i tre exemplar i ett 9x9 mönster (figur 1E, 1F).
  6. Starta microarrayer att skriva ut bilderna antikroppar microarray.
  7. Samla bilderna antikropp microarray, och lagra dem i bilder kassett med torkmedel. Vakuumförsegla kassetten i en plastpåse genom användning vakuumförseglare (Foodsaver).
  8. Lagra de förseglade microarray objektglasen vid 4 ° C i kylskåp.

2. Kemiskt Blockera Antibody Microarray att förebygga GBPBindning till infångningsantikroppar

Den microarray analysen börjar när microarray bilderna är kemiskt blockerade och varar i cirka 8 timmar. När började microarray analysen måste avslutad (steg 2 till 8).

  1. Ta mikromatris glider ut ur kylskåpet och jämvikta dem till rumstemperatur under 30 minuter.
  2. Ta bort den från lagringsboxen och kortfattat skölja dem i fosfatbuffrad saltlösning pH 7,2 med 0,1% Tween 20 (PBST0.1) en gång i en slid tvättställ, och sedan i 15 mM natriumacetatbuffert pH 5,0 med 0,1% Tween (CBT0 0,1) på ett sekventiellt sätt. Inkubera objektglasen i CBT0.1 i 10 minuter i bilden tvätt bassäng.
  3. Bered en färsk 150 mM NalO 4 i 15 mM natriumacetat pH 5,0 (CB), och hålla i med en bild tvätt bassäng i ett kylskåp och samtidigt undvika ljus innan användning.
  4. Ta bort bilden från CB och satte den i bassängen med färskt NalO 4 med antikroppen sidanuppåt. Täcka bassängen med aluminiumfolie för att undvika ljus, och inkubera sliden bassängen under 2 timmar med försiktig skakning vid 4 ° C i ett kylskåp.
  5. Framställ 300 ml 10 mM hydrazid glutaminsyra (blockeraren) i CB.
  6. Ta bort bild från bassängen, och kort skölj den i CB 3 gånger i 5 minuter varje gång i bild tvätt bassäng.
  7. Inkubera objektglasen i blockerare i en tvätt bassäng under 2 timmar vid rumstemperatur med försiktig skakning.
  8. Ta bort bilder från bassängen och tvätta dem med PBST0.1 i 3 minuter.

3. Blockera icke-specifika bindningar till mikromatrisen med bovint serumalbumin (BSA)

  1. Framställ 300 ml 1% BSA i fosfatbuffrad saltlösning pH 7,2 med 0,5% Tween (PBST0.5) i en slid tvättställ och inkubera i mikroskaran sliden i bassängen under 1 timme vid rumstemperatur med försiktig skakning.
  2. Skölj glasen i PBST0.1 tre gånger i 3 minuter varje gång.
  3. Sätt bildenpå en bild rack och centrifugera vid 1200 xg på en centrifugering i 2 minuter för att torka microarray bilden.

4. Imprint Wax Grid på Microarray Slide att separera varje subanordningen

  1. Förvärmning av vax tryckverket vid 70 ° C under 5 minuter.
  2. Ladda blockerade microarray glider in vaxet tryckverket med antikropp sidan vänd mot vaxet. Dra försiktigt i handtaget för att avtryck vax på bilden jämnt.

5. Applicera serumprover på Microarray Slide

  1. Under Steg 2,4, förbereda serumprover för antingen Glyco profilering analys i ett prov (5.1.1), eller enstaka Glyco epiptope mätning mellan flera prover (5.1.2).
    1. I ett experiment för glykanen profileringar av flera serum glykoproteiner i ett serumprov genom att använda flera GBPs (se exempel experiment 1), kommer en serumprover appliceras på alla subsystemen. I detta fall är 40 | il serum riklig späddes i 360 | il av PBS innehållande 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml mus-IgG, 100 | ig / ml rått-IgG, 100 | ig / ml kanin-IgG, 100 | ig / ml av get-IgG och 100 pg / ml åsna-IgG. Denna volym är tillräcklig för att tillämpa 6 pl utspätt serum lösningen på varje undersystem.
    2. I ett experiment för en glykan mätning på flera serumproteiner bland flera serumprover med hjälp av en GBP detekteringar (se prov experiment 2). I detta fall är 1 il serum riklig späddes i 9 | il av PBS innehållande 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml mus-IgG, 100 | ig / ml rått-IgG, 100 | ig / ml kanin-IgG , 100 pg / ml av get-IgG och 100 | ig / ml åsna-IgG. Denna volym är tillräcklig för att tillämpa 6 il utspätt serum lösningen på varje undersystem.
  2. Efter vax avtryck i steg 4, tillämpas försiktigt 6 pl av utspätt prov eller kontrollprover (PBST0.1) till varje undergrupp av bilden. Inkubera bilden i en fuktad kassett med våta pappershanddukar vid rumstemperaturunder 1 timme.
  3. Skölj sliden med PBST0.1 tre gånger i 3 minuter varje gång.
  4. Torka bilden genom att snurra den i 1200 xg för 2 minut.

6. Applicera Biotinylerad GBP (Lektin eller Anti-glykan antikropp) på Slide

  1. Under Steg 2,4, förbereda 10 M-g/ml av biotinylerade lektiner / Gbps i PBST0.1.
    1. I glykanen profilering experiment som prob ett prov med flera lektiner (prov experiment 1), förbereda 350 pl biotinylerat lektin som är tillräcklig för alla subsystemen.
    2. I enkel glykan epitop / biomarkör screening i ett flertal prover genom att använda flera lektiner, framställa 10 | il av varje biotinylerade lektinet som är tillräcklig för en subanordningen.
  2. Applicera 6 pl av det utspädda biotinylerat lektin (er) till varje undergrupp av bilden och inkubera i fuktig bilden lådan med våta pappershanddukar vid rumstemperatur under 1 timme.
  3. Skölj objektglasen med PBST0.1 tre gånger under 3 minuter vardera timig.
  4. Torka bilden genom att snurra den på 1200 xg i centrifug för 2 minut.

7. Applicera färgämnesmärkta neutravidin för fluorescensdetektering

  1. Framställ 350 | il av märkt Dylight 549 neutravidin som är tillräcklig för alla subsystemen.
  2. Tillämpas 6 | il av märkt Dylight 549 neutravidin på varje undersystem, och inkubera plattan i den fuktsatta sliden kassetten vid rumstemperatur under 1 timme.
  3. Skölj sliden med PBST0.1 tre gånger i 3 minuter varje gång.
  4. Torka objektglaset genom att spinna det vid 1200 xg i centrifug för 2 minut.

8. Skaffa Microarray diabilden genom att skanna Slide

  1. Skanna bilden genom att använda en fluorescens microarray scanner vid 10 m upplösning. Laser och PMT inställningar bör vara så stark som möjligt, men ingen mättnad fläck observeras.

9. Data Extraktion och analys

  1. Öppna bilden i ArrayPro 3,2. Ställ in arrayen mall enligt matrisen karta som visar antikroppar fläckar platser. Noggrant inrikta varje mall cirkel på motsvarande plats i bilden.
  2. Utdrag intensiteten för varje punkt i en Excel-fil för vidare analys.

10. Representativa resultat

Prov Experiment 1

Glykosylering profilering av flera serum glykoproteiner i hepatocellulär cancer patienten serumprov genom att använda kemiskt blockerad antikropp microarray med flera lektiner upptäckt.

Målet med detta experiment är att undersöka den individuella glykosyleringsprofil 20 glykoproteiner i hepatocellulär cancer (HCC) patientens serumprov med kemiskt blockerade antikropp microarray med lektin upptäckt. En antikropp microarray, som innehåller 48 identiska subsystem som omfattar 26 antikroppar och biotin-BSA, har konstruerats och tillverkats enligt beskrivningen i STEP 1. Dessa 26 antikroppar var mot 20 serum glykoproteiner som identifierats som lovande tidig diagnos värde för HCC patienter med lektin baserad immunoprecipitation kombineras med masspektrometrisk proteinidentifiering 12, 32 som visas i tabell 1. Mönstret och arrangemanget av antikropp fläckar trycks i triplikat i en representativ undergrupp visas i figur 1e och 1f, respektive. Två identiska microarray bilder, var ett kemiskt blockerad (Figur 1A), medan den andra on (Figur 1B), användes för att utföra samma experiment glykosylering profilering för att visa betydelsen av kemiskt blockera förfarandet för analysen. För det kemiskt blockerade sliden (figur 1B) började försöket vid steg 2, för att inget kemiskt blockerade slid (figur 1 A), började försöket från steg 3. Experimentet utfördes genom following alla steg som beskrivs i protokollet, utom för steg 5.1.2 och 6.1.2. I Steg 5,2 tillsattes en PBST0.1 kontrollprov applicerades på subanordningar i kolonn 1 och 3, och en poolad HCC serumprov sattes på subanordningar i kolumn 2 och 4, respektive (såsom visas i figur 1 g). Denna jämförelse är att visa effektivitet i förfarandet, liksom antigen bindningsaffiniteten av antikroppar efter kemiskt blockering. 22 biotinylerade lektiner (såsom visas i Tabell 1) som är specifik för olika glykaner 18, 20 applicerades på varje undersystem som visas i figur 1 G för glykosylering profilering. Bilder av de kemiskt blockerade (Figur 1B) och icke-kemiskt blockerade (Figur 1A) microarrays efter glykosyleringen profileringen analysen genom att följa protokollet. Som framgår av subsystem i kolumn 1 och 3 i icke-kemiskt blockerade microarrays (Figur 1A och Figur 1C), på vilkaEndast PBST0.1 tillämpades de flesta lektiner bunden att fånga antikroppar och visade mycket hög bakgrund som kan jämföras med de subsystem i kolumn 2 och 4, som serumprovet har tillämpats. Det är omöjligt att få glykanen profilinformation från microarray bild. Tvärtom, när samma experiment utfördes på en kemiskt blockerad antikropp mikromatris sliden, de subsystem i kolonn 1 och 3, på vilken endast PBST0.1 applicerades visade de flesta lektiner inga eller mycket låga bindningar för att fånga antikroppar, medan hög-antigen bindningar observerades fortfarande i subsystemen i kolumn 2 och 4, på vilken serum-prov applicerades (Figur 1B och 1D). Dessa resultat visade kemiskt blockera förfarandet var ett avgörande steg framåt mätning av glykaner på antikroppar fångade-glykoproteiner. Genom att följa protokollet kan glykosylering profiler 22 glykoproteiner i HCC serum erhållas.

Experiment 2

Skärm för förändrade fucosylation på specifika serum glykoproteiner som biomarkörer för diskriminerade levercirros och hepatocellulära patienter karcinomceller.

Målet med detta experiment är att screena för ändrade fukosylering på specifika serum glykoproteiner som biomarkörer som diskriminerar levercirros och hepatocellulär cancer (HCC) patienter. Skiljer sig från den Experiment 1, i vilken endast en serum-prov applicerades på vart subanordningar och sonderades med olika lektiner, i denna analys, totalt 40 olika serumprov från HCC och cirros patienter applicerades på varje undersystem och sonderades med en lektin (AAL ). Statistisk analys, såsom T-test, mottagare i drift Characteristic (ROC) kurva, gjordes för att utvärdera fördelningen eller diagnostisk prestanda hos glykan epiptope / biomarkör för varje individuellt protein i alla serumprover. Vi använde samma antikropp mikromatrisen tillverkas i experiment 1, utom för anti-CA19-9-och anti-Lewis X-antikroppar i denna studie. Den kompeiment genomfördes från 2 september till steg 9 med undantag för steg 5.1.1 och 6.1.1. Totalt 40 serumprover från 20 cirros och 20 patienter HCC applicerades slumpmässigt undergrupp av de 48 subsystem tillsammans med kontrollgrupperna PBS prover som negativ kontroll. Fukosylering av varje fångade proteinerna sedan detekteras med hjälp biotinylerad Fukos-specifik lektin. Mikromatrisen bilden som visas i figur 1 visade lektinet AAL endast bundet till serumproteiner infångade på mikromatrisen (Figur 2D) i stället för infångade antikroppar (Figur 2E). De AAL bindande intensiteten hos alla de punkter extraherades sedan och analyserades med hjälp av T-test och ROC kurvor för att utvärdera prestanda fukosylering (AAL bindande intensitet) för varje serum protein på diskriminering mellan HCC och grupper cirros. Resultaten visade att fukosylering av GP73-protein gav den bästa diskriminering mellan de två grupperna med ett p = 0,03 och ytan under-kurva av ROC-kurvan är lika med 0,72. Detta experiment visade detta förfarande är en snabb, effektiv metod för glykanen epitopen / biomarkör screening på flera prov inom flera proteiner.

ID Namnet på reagens Förkortning Företaget Katalog #
L1 Biotinylerad Concanavalin A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinylerad Sambucus Nigra Lektin SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinylerad Lens culinaris agglutinin LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinylerad Ricinus communis agglutinin I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinylerad Aleuria Aurantia Lektin AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinylerad Erythrina cristagalli Lektin ECL- Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinylerad Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia-lektin II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinylerad vetegroddsagglutinin WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Biotinylerad Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Biotinylerad Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Biotinylated jordnötsagglutinin PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinylerad Pisum sativum agglutinin PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinylerad Dolichos biflorus agglutinin DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Biotinylerad Datura stramonium Lektin DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinylerad Sophora Japonica agglutinin SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Biotinylerad Soybean agglutinin SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinylerad Solanum tuberosum (potatis) Lektin STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Biotinylerad Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia-lektin I GSL I Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinylerad Vicia villosa Lektin VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinylerad Lycopersicon esculentum (tomat) Lektin LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Biotinylerad Ulex Europaeus agglutinin I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinylerad jakalin Jacalin Vector Laboratories BK-3000
A1 Get F (ab ') 2 fragment anti-humant IgM, Fc5μ antikropp IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Åsna F (ab ') 2Frag-anti-humant IgG (H + L)-antikropp AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Mus-anti-human IgG F (ab ') 2-monoklonal antikropp AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Get-anti-human alfa 2-makroglobulin polyklonal antikropp A2M GeneTex GTX62924
A5 Kanin-anti-human alfa-1-antitrypsin-polyklonal antikropp A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Mus-anti-human alfa-1-antitrypsin-monoklonal antikropp A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Kanin-anti-human alfa-1-antitrypsin-polyklonal antikropp AGERA NeoMarkers RB-367-A1
A8 Kanin-anti-human alfa-1-antikhymotrypsin polyklonal antikropp AGERA Fisher Scientific RB9213R7
A9 Mus-anti-humant transferrin monoklonal antikropp Transferrin GeneTex GTX101035
A10 Kanin-anti-humant transferrin polyklonal antikropp Transferrin GeneTex GTX77130
A11 Get-anti-human apolipoprotein J polyklonal antikropp ApoJ Abcam ab7610
A12 Mus-anti-human GP73 monoklonal antikropp GP73 Abbott 14H4-23
A13 Mus-anti-human GP73 monoklonal antikropp GP73 Santa Cruz Biotechnology Inc sc-101.275
A14 Kanin-anti-human alfa-1 fetoprotein polyklonal antikropp AFP GenWay GWB-41C966
A15 Mus-anti-human alfa-1 fetoprotein monoklonal antikropp AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Mus-anti-human hemopexin monoklonal antikropp Hemopexin Assaypro 60.190-05.011
A17 Mus-anti-human glypican-3 (1G12) monoklonal antikropp GPL3 Santa Cruz Bio sc-65.443
A18 Mus-anti-human kininogen (LMW) monoklonal antikropp Kininogen Assaypro 20.333-05.011
A19 Kanin-anti-human MMP-21 monoklonal antikropp MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Mus-anti-human CEACAM-1 monoklonal antikropp CEACAM R & D Systems MAB1180
En21 Råtta anti-human-DPPIV/CD26 monoklonal antikropp DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Mus-anti-human PIUKA II monoklonal antikropp PIVICA Kristall Chem 8040
A23 Mus-anti-karcinoembryonalt antigen CEA US biologiska C1300
A24 Mus-anti-CA125 cancerantigen CA 125 US biologiska C0050-01D
A25 Mus-anti-CA19-9 Cancer antigen CA19-9 US biologiska C0075-18
A26 Mus-anti-Lewis x-monoklonal antikropp Lewis X- Calbiochem 434.631
bio Biotinylerat BSA (positiv kontroll) Bio Home-made N / A

Tabell 1. Förteckning över lektiner och antikroppar som används i detta protokoll.

Reagensets namn s / utrustning Företaget Katalognummer
Icke kontakt microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 mikroplatt Fisher 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultratunna nitrocellulosa coate mikromatris glider Gentel VÄG
Skjut tryckverk (tillval) Den Gel Företaget WSP60-1
Skakanordning Fisher 15-453-211
Centrifugera Eppendorf 5804 000.013
Skjut tvätt bassäng / Slide wi färgning Dishte Löstagbar rack Fisher 08-812
Slide inkubationskammaren / objektglas box Fisher 03-448-5
Brij 35, 30 vikt / volym% lösning i vatten Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher P337-100
Natriumperiodat (NalO 4) Sigma 311.448
L-Glutaminsyra γ-hydrazid Sigma G-7257
Natriumacetat Vattenfri (CH3 COONa) Sigma S2889
Bovint serumalbumin (BSA) Lampire Biologisk Labs 7500804
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 konjugerad neutravidin Thermo 22.837
Proteasinhibitorcocktail Tabletter Roche 4693159001
ChromPure Humant IgG, Fc-fragmentet Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure Humant IgG, hel molekyl Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure mus-IgG, hel molekyl Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure mus-IgG, Fc-fragmentet Jackson Immunoresearch 015-000-008
ChromPure Kanin-IgG, hel molekyl Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure åsna-IgG, hel molekyl Jackson Immunoresearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabell 2. Listav utrustning och reagenser som används i detta protokoll.

Schema 1
Schema 1 Ett schema som visar lektin antikroppen microarray baserad glykanen biomarkörer process 1 (steg 2 till 4): Blockera antikroppen microarray med blockerare (Glu-hydrazid) och BSA, 2 (steg 5).. Gäller serumprover och fånga specifika glykoproteiner med specifika antikroppar, 3 (Steg 6): tillämpas biotinylerad lektin (er); 4 (steg 7): Sond den biotinylerade AAL med Dylight märkt 549 neutravidin för mikromatris avbildning.

Figur 1
Figur 1. Microarray bilder av provet Experiment 1 glykosylering profilering av multipla serum glykoproteiner i HCC patientserumprov med hjälp Pharmacallierad blockerad antikropp microarray med flera lektin upptäckt. Två identiska microarray bilder, (A) ingen blockerad kemiskt, eller (b) kemiskt blockerade som beskrivs i steg 2, båda gick igenom alla steg från 2 till 9 för glykosylering profilering samt jämförande syfte. (A) och (B) är microarray bilderna scannas i steg 8 i en resolution av den 10 mikron. (C) zooma in bilden av de två första raderna i någon blockerade kemiskt microarray bild (A), (D) zooma in bilden av de två första raderna i den icke kemiskt blockerade microarray bild (B)), (E) diagrammet av antikroppen arrangemanget inom varje undergrupp, (F) array kartor: placeringen av varje antikropp i subsystemet representerar varje antikropp namn 3 fläckar, (G) Serum provet och lektin plats: Ett diagram visar vilka subanordningen varje serum prov och lektinet appliceras på.

Figur 2
Figur 2. Microarray bilder avurval experiment 2 skärm för ändrade fukosylering på specifika serum glykoproteiner som biomarkörer som diskriminerar levercirros och patienter HCC. Mikromatrisen analysen utfördes såsom beskrivits i Exempel Experiment 2 sektionen. (A) hela diabilden i mikromatrisen sliden från steg 8, (B) i diagrammet av antikroppen arrangemanget inom varje undergrupp; (C) array kartor: placeringen av varje antikropp i den subanordningen, representerar varje antikropp namn 3 fläckar; (D) en zoom-i bilden av en subanordning som inkuberades med serumprov, (e) en zoom-i bilden av en subanordning som inkuberades med PBS-kontroll.

Figur 3
Figur 3. Glykan profilering resultat från provet experiment 1. Varje stapel representerar lektinbindning profil (eller glykan profiler) av en av 20 testade proteinet. Totalt 22 olika lektiner användes för att analysera: ee glykan profil av varje protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Målprotein och infångningsantikropp valet

Före antikroppen microarray analysen, vissa reagenser och material måste beaktas och förberedas. Att designa en antikropp microarray för glykanen profilering eller glykan biomarkör screening, en panel av antikroppar som är specifika för glykoprotein kandidater bör fastställas enligt litteraturen eller från tidigare resultat. Dessa antikroppar var vanligen köptes från olika leverantörer som R & D Systems etc. IgG är att föredra infångningsantikroppar sedan våra tidigare tester visade att en del IgM och IgE helt kan förlora sina antigen bindningsaffiniteter efter kemisk modifiering.

2. Konstruktion och tillverkning av antikroppar microarray

Tillverkning av antikroppen microarray är ett valfritt steg som behöver professionell och dyra microarrayer, och väl utbildad personal för drift. Men anpassade antikropp microarray tillverkningning lätt kan göras från en tjänsteleverantör såsom Serome Biosciences Inc. För en robust resultat rekommenderas en beröringsfri microarrayer, såsom Scienion sciFLEXARRAYER ultralåg volym beröringsfri microarrayer, som användes i vår antikropp mikromatris tillverkning. Hög bindningskapacitet microarray objektglas, såsom PATH (Gentel Bio Inc. WI) eller Sida H (Shott, PA).

3. Välj och Förbered glykan bindande proteiner (Gbps) för glykosylering profilering

GBPs att rikta olika mono-eller oligosackarider kan hittas i litteraturen och genom en sökmotor som utvecklats av Haab laboratoriet 29 och hölls vid den translationella Genomics Institute För att välja GBPs med hög specificitet och affinitet tillriktade glykan epitoperna, välj motiv (epitop) från rullgardinsmenyn och klicka på "Sök". Det GBPs specifikt för detta motiv (epitop) kommer att listas i enlighet med deras logP värde från hög till låg ordning. Högre logP indikerar en starkare bindning affinitet och specificitet till glykanen motivet / epitop. På grund av den inneboende icke-specifik bindning fråga från lektin, är denna metod fortfarande inte så optimal som antikroppen baserad analys. Därför rekommenderar vi starkt att anti-glykan antikroppar används, såsom anti-Lewis x eller anti-sialyl Lewis A-antikroppar, om de finns tillgängliga. Användning av flera GBPs för detektering är en annan strategi för att dubbelkontrollera olika bindande profiler och att få tillförlitliga bindande uppgifter.

4. Dataanalys

Eftersom denna metod används för att detektera nativa serumproteiner, kan protein-protein-komplex kan infångas och detekteras. Western blöt eller masspektrometri är bra metoder för att validera de mikroarraydata. Under tiden, Detektion av proteinnivåer med samma microarray är en annan metod att lära sig detaljerna i glykosylering förändring av proteinet, till exempel om de förändringar berodde på den totala proteinhalten förändring eller bara att glykosylering nivån ökat på varje proteinerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Institutet för hepatit och Virus Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Kemiskt blockerad antikropp Microarray för Multiplexade hög kapacitet profilering av specifik proteinglykosylering i komplexa prover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter