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Immunology and Infection

एकल कक्ष का विश्लेषण बेसिलस subtilis प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो का उपयोग Biofilms

Published: February 15, 2012 doi: 10.3791/3796
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute for Molecular Infection Biology (IMIB), University of Würzburg

Summary

माइक्रोबियल biofilms विशेष कोशिकाओं की अलग subpopulations द्वारा आम तौर पर गठन कर रहे हैं. इन उप - जनसंख्या की एकल कोशिका विश्लेषण फ्लोरोसेंट पत्रकारों के उपयोग की आवश्यकता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए कल्पना और कई subpopulationswithin की निगरानी

Abstract

Biofilm गठन लगभग सभी बैक्टीरिया 1-6 के लिए एक सामान्य विशेषता है. जब बैक्टीरिया biofilms रूप कोशिकाओं कि ज्यादातर और प्रोटीन exopolysaccharides द्वारा गठित अन्य 7-10 कारकों के बीच, बाह्य मैट्रिक्स में encased है. माइक्रोबियल समुदाय में biofilm भीतर अक्सर encased के विशेष कोशिकाओं 11-17 की अलग subpopulation की भिन्नता से पता चलता है. इन उप - जनसंख्या में एक समय में होना और अक्सर 18-21 biofilm भीतर स्थानिक और लौकिक संगठन दिखा.

मॉडल जीव बेसिलस subtilis में biofilm गठन विशेष कोशिकाओं की अलग subpopulations के भेदभाव की आवश्यकता है. उनमें से,. मैट्रिक्स निर्माता, उत्पादन और biofilm के बाह्य मैट्रिक्स छिपाना जिम्मेदार subpopulation biofilm गठन 11,19 के लिए आवश्यक है. इसलिए, मैट्रिक्स उत्पादकों के भेदभाव बी में biofilm गठन की एक बानगी है subtilis.

हम फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से इस्तेमाल किया है बी के biofilms में कल्पना और मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation यों 15,19,22-24 subtilis. Concretely, हमने देखा है कि मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation स्वयं का उत्पादन कोशिकी संकेत 25 surfactin की उपस्थिति के जवाब में अंतर है. दिलचस्प है, surfactin विशेष मैट्रिक्स पन्द्रह उत्पादकों के subpopulation से अलग कोशिकाओं के subpopulation द्वारा निर्मित है.

हम इस तकनीकी कल्पना और बी subtilis की biofilms भीतर मैट्रिक्स उत्पादकों और surfactin उत्पादकों के subpopulation यों आवश्यक दृष्टिकोण रिपोर्ट में विस्तृत है. ऐसा करने के लिए, मैट्रिक्स उत्पादन और surfactin उत्पादन के लिए आवश्यक जीन के फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से बी. के गुणसूत्र में डाला जाता है subtilis. रिपोर्टर केवल विशेषज्ञता कोशिकाओं के एक subpopulation में व्यक्त कर रहे हैं. फिर, उप - जनसंख्या हो सकते हैंप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry (चित्र 1 देखें) का उपयोग पर नजर रखी.

तथ्य यह है कि विशेष कोशिकाओं के विभिन्न subpopulations बैक्टीरिया की multicellular समुदाय के भीतर एक समय में होना हमें prokaryotes में जीन अभिव्यक्ति के नियमन के बारे में एक अलग परिप्रेक्ष्य देता है. यह प्रोटोकॉल इस घटना प्रयोगात्मक पते और यह आसानी से किसी भी अन्य काम कर रहे मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, आणविक एक सूक्ष्म समुदाय प्ररूपी विजातिता के भीतर अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट.

Protocol

1. लेबल बी. subtilis और biofilm गठन परख

  1. पीसीआर द्वारा ब्याज की जीन के प्रमोटर क्षेत्र बढ़ाना. हम उदाहरण के रूप में पी tapa, TasA मैट्रिक्स 26 प्रोटीन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार जीन के प्रमोटर की क्लोनिंग दिखा. Pkm008 वेक्टर (Rudner प्रयोगशाला, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल बोस्टन, संयुक्त राज्य अमेरिका के द्वारा बनाई गई) में क्लोन पी tapa (छवि 2).
  2. Plasmids enzymatic पाचन (एनजाइम अनुशंसित, XhoI) के द्वारा Linearize.
  3. बी में प्राकृतिक क्षमता प्रेरित करना. subtilis एक कदम हारवुड द्वारा पहले वर्णित प्रोटोकॉल के बाद और 27 काटना द्वारा 168 तनाव.
  4. सक्षम कोशिकाओं की संस्कृति के linearized plasmids में जोड़ें और ऊष्मायन के दो घंटे के बाद spectinomycin प्रतिरोध के लिए चयन.
  5. प्राप्त खींच बी की तटस्थ amyE के बिन्दुपथ में निर्माण सम्मिलित है डबल पुनर्संयोजन द्वारा subtilis (चित्र 4). बनाने केएक डबल लेबल तनाव, ठिकाना lacA तटस्थ में प्लाज्मिड pDR183 हम 3 आकृति में मौजूद का उपयोग करके दूसरे संवाददाता एकीकृत. इस संवाददाता हम पत्रकारों की प्रविष्टि pKM008 में क्लोन के लिए ऊपर वर्णित एक ही तकनीक का उपयोग कर डालें.
  6. 168 तनाव से संवाददाता स्थानांतरण NCIB3610 कि biofilms रूप में सक्षम है. SPP1 फेज पारगमन 28,29 प्रोटोकॉल का उपयोग करें. TY माध्यम में दाता तनाव (लेग 10 मिमी MgSO, 4 10 माइक्रोन 4 MnSO में) आगे बढ़ें. फेज शेयर कमजोर पड़ने की 100 μl के साथ संस्कृति की 200 μl मिश्रण. ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद नरम अगर 3 मिलीलीटर जोड़ें और फेज halos 37 पर उत्पन्न करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस
  7. नरम अगर लीजिए. यह अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला पारित एक सिरिंज .22 माइक्रोन फिल्टर सोचा. इस सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करने के लिए प्राप्तकर्ता TY मध्यम में बड़े तनाव का एक संस्कृति को संक्रमित करने के लिए. 30 μl के लिए 10 संस्कृति पतला 1:10 की मिलीलीटर जोड़ें. 30 मिनट के लिए सेते हैं और चयन ऊष्मायन 24 घंटे के बाद एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए.
  8. सेएक कॉलोनी लेवल और 37 में यह लेग पर रातोंरात बढ़ने डिग्री सेल्सियस
  9. ठोस biofilm उत्प्रेरण 1.5% 30 अगर MSgg है मध्यम 3 रातोंरात संस्कृति की μL स्पॉट. कोशिकाओं को 72 घंटे के दौरान 30 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3) में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. विकास के तीन दिनों के बाद, biofilms MSgg अगर की सतह पर गठित अगर की सतह में एक जटिल रूपात्मक वास्तुकला विकसित.

2. Biofilm फैलाव और सेल फिक्सेशन

  1. Biofilm फार्म MSgg अगर एक दन्तखुदनी या चिमटी का उपयोग कर की सतह निकालें. biofilm की स्थिरता आप यह एक टुकड़ा में अगर की सतह से दूर छील करने के लिए अनुमति चाहिए.
  2. पीबीएस बफर के 3 मिलीग्राम में biofilm प्लेस और एक विंदुक या एक सुई के माध्यम से दोहराए मार्ग द्वारा biofilm फैलाने. वैकल्पिक रूप से, biofilm फैलाव हल्के sonication का उपयोग किया जा सकता है. हल्के sonication 3 के एक उत्पादन और 0.7 सेकंड के आयाम के साथ 12 दालों की आवश्यकता है.
  3. नमूने पूर्व विश्लेषण सेल एकल फिक्स. Resuspen1 मिलीग्राम 4% paraformaldehyde की और कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं में सात बिल्कुल मिनट के लिए सेल निलंबन की 300 μL.
    4% paraformaldehyde समाधान की संरचना:
    Paraformaldehyde की 2 ग्राम
    पीबीएस बफर के 50 मिलीलीटर
    4 μl 10 एन NaOH
    0.22 उम फिल्टर और अशेष भाजक के माध्यम से समाधान फ़िल्टर
  4. पीबीएस बफर में नियतन तीन बार के बाद कोशिकाओं धो और उन्हें 300 पीबीएस बफर के μL में resuspend है.

3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. एक खुर्दबीन स्लाइड पर 0.8% agarose की 200 μL डालो और ध्यान से यह एक और स्लाइड के साथ कवर किया. 2 मिनट के बाद ऊपरी स्लाइड धीरे के agarose की एक परत के नीचे स्लाइड से जुड़ी प्राप्त निकालें.
  2. स्पॉट agarose परत की सतह पर तय की कोशिकाओं के 2 μL और यह एक खुर्दबीन कवर के गिलास के साथ कवर.
  3. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन नमूना रखें. हम एक Leica CRT6000 iIluminat के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन Leica DMI6000B उपयोग करतेप्रणाली आयन. YFP के लिए पूर्व फिल्टर कर रहे हैं: BP500/20, उन्हें: BP535/30 के और CFP फ्रैंक के लिए पूर्व: BP426/20, उन्हें: 40/480
  4. अपने नमूना बेनकाब 50-200 एमएस बीच एक उत्तेजना प्रतिदीप्ति. एक नकारात्मक नियंत्रण है जो प्रयोग के लिए चयनित की स्थिति में नहीं प्रतिदीप्ति पता चलता है के अनुसार उत्तेजना अवधि निर्धारित करें.
  5. एक ही छवि उज्ज्वल क्षेत्र के साथ प्राप्त करने के लिए प्रतिदीप्ति छवि संदर्भ लें. एक चित्र में दो छवियों को मर्ज. प्रवाह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक एकल लेबल संवाददाता tapa YFP पी 6 आंकड़ा में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं की शरण तनाव से प्राप्त परिणाम है.

4. एकल कक्ष की मात्रा फ्लो का उपयोग

  1. निश्चित हल्के sonication का उपयोग कोशिकाओं का नमूना फैलाने. 5 के एक उत्पादन और 0.7 सेकंड के आयाम के साथ 12 दालों की श्रृंखला 2 के प्रदर्शन नमूना Sonicate, सेल के कारण के बिना एकल कक्षों में clumps को फैलाने के लिए. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल फैलाव की क्षमता की पुष्टि करें. पीबीएस बफर में प्रवाह cytometry विश्लेषण से पहले 1:100 नमूना पतला. हम एक प्रवाह cytometer बी.डी. FACS द्वितीय सर्ग का उपयोग करें. YFP प्रतिदीप्ति के लिए, 488 एनएम पर एक 530/30 फिल्टर के साथ मिलकर एक लेजर उत्तेजना का उपयोग करें. CFP फ्रैंक प्रतिदीप्ति के लिए, 405 एनएम पर एक 408/40 फिल्टर के साथ मिलकर लेजर उत्तेजना का उपयोग करें.
  2. दो नकारात्मक नियंत्रण के साथ जांचना प्रवाह cytometer मशीन. पीबीएस बफर के निलंबन में कोई कोशिकाओं के साथ एक नमूना कणों के आकार के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्रवाह कोशिकामापी द्वारा लगा के रूप में सेवा करनी चाहिए. एक कोई प्रतिदीप्ति संवाददाता के साथ लेबल नमूना प्रवाह cytometer की प्रतिदीप्ति संवेदनशीलता के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम किया जाना चाहिए.
  3. प्रवाह cytometer में फ्लोरोसेंट संवाददाता के साथ लेबल नमूना रखें. प्रत्येक नमूना के लिए, प्रति सेकंड 300 और 3000 की घटनाओं के बीच एक प्रवाह की दर के साथ कम से कम 50,000 की घटनाओं का विश्लेषण.
  4. FACS दिवा सॉफ्टवेयर (बी.डी. बायोसाइंसेज) का उपयोग कर डेटा पर कब्जा है और यह विश्लेषण FlowJo 8.5.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. नियंत्रण है कि शो के लिए प्रतिदीप्ति संकेत संदर्भ लेंकोई प्रतिदीप्ति.
  5. दो अक्षों ग्राफ़िक में एकल लेबल तनाव के प्रतिदीप्ति संकेत निगरानी डेटा प्रस्तुत करते हैं. प्रतिदीप्ति एक्स अक्ष और y अक्ष में प्रतिदीप्ति के विभिन्न स्तरों को व्यक्त कोशिकाओं की संख्या में पाया संकेत साजिश है. प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग एक एकल लेबल संवाददाता tapa YFP पी संख्या 8 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं की शरण तनाव से प्राप्त परिणाम है.
  6. तीन अक्षों ग्राफ़िक डबल - लेबल तनाव के प्रतिदीप्ति संकेत निगरानी डेटा प्रस्तुत करते हैं. एक्स और वाई axes (उदाहरण के लिए, GFP CFP फ्रैंक और शाफ़्ट में एक्स अक्ष में मापा जा) में निगरानी चैनलों में से हर एक की प्रतिदीप्ति संकेत साजिश है. Z-अक्ष में प्लॉट प्रत्येक रिपोर्टर और उन्हें समोच्च isolines सीधा है कि कागज के हवाई जहाज (9 और 10) छवि होगा के रूप में उपस्थित व्यक्त कोशिकाओं की संख्या.

4. प्रतिनिधि परिणाम

जब बी. subtilis ख के एक थाली पर बढ़ता हैiofilm उत्प्रेरण मध्यम MSgg, biofilm गठन ऊष्मायन के तीन दिनों के बाद 30 ° सी 30 पर मनाया जाता है. इस biofilm मजबूत स्थिरता से पता चलता है और यह एक टुकड़ा में अगर की सतह से से खुली किया जा सकता है. इसके अलावा, biofilm एक जटिल रूपात्मक वास्तुकला है कि विशिष्ट भाग लेने सेल subpopulations छवि (5) का संकेत है दर्शाता है. उदाहरण के लिए, कॉलोनी की सतह पर झुर्रियों के गठन में biofilms परिणामों में बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन. यह सुविधा मैट्रिक्स 19 उत्पादकों की subpopulation की भिन्नता के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. इसी प्रकार, हवाई संरचनाओं की स्थापना biofilm की सतह पर कोशिकाओं के sporulating subpopulation की उपस्थिति का संकेत है, के बाद से spores इन 30 संरचनाओं के शिखर क्षेत्र में स्थानीयकृत है.

सेल भेदभाव के दृश्य की एक एकल लेबल और एक डबल लेबल तनाव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं अनुसंधान में उदाहरणआंकड़ा 6 और 7 में क्रमशः epresented,. एकल लेबल तनाव फ्लोरोसेंट संवाददाता बंदरगाहों tapa - CFP फ्रैंक पी कि मैट्रिक्स उत्पादक कोशिकाओं की subpopulation में व्यक्त किया है. इस subpopulation बाह्य मैट्रिक्स कि biofilm छवि (6) के गठन के लिए उत्पादन और छिपाना जिम्मेदार है. डबल लेबल तनाव संवाददाता बंदरगाहों tapa, 26 CFP फ्रैंक और अतिरिक्त संवाददाता srfAA - YFP 31 पी पी. यह दूसरा पत्रकार के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं के subpopulation है संकेत अणु surfactin के, जो मैट्रिक्स उत्पादकों के भेदभाव छवि (7) के लिए संकेत झरना ट्रिगर छिपाना की निगरानी की अनुमति देता है. मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation नीले रंग में रंग झूठे हैं जबकि surfactin उत्पादकों की subpopulation पीले रंग में रंग गलत है.

प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर एक एकल लेबल तनाव शरण संवाददाता tapa YFP पी संख्या 8 में प्रस्तुत किया है. अनुपचारित नियंत्रण तनाव को शरण नहींकिसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन एक एकल जनसंख्या कम सापेक्ष प्रतिदीप्ति दिखाया. गैर biofilm से उत्प्रेरण परिस्थितियों में tapa YFP पी शरण कोशिकाओं मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation अंतर नहीं था और पूरी आबादी कम सापेक्ष प्रतिदीप्ति दिखाया. Biofilm से उत्प्रेरण हालत में, उच्च सापेक्ष प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं के एक subpopulation हुआ, सापेक्ष कम प्रतिदीप्ति 23 शिखर की सही करने के लिए एक कंधे के रूप में मनाया.

प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर एक डबल लेबल तनाव से प्राप्त परिणाम आंकड़ा 9 और 10 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. आंकड़ा 9 मैट्रिक्स उत्पादकों और surfactin के निर्माता डबल लेबल तनाव tapa - CFP फ्रैंक, srfAA YFP पी पी का उपयोग करते हुए उप - जनसंख्या पर नजर रखी. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के नियंत्रण के रूप में हम तनाव नहीं किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन को शरण देने का इस्तेमाल किया. अगला, हम प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में मैट्रिक्स उत्पादकों और surfactin उत्पादकों के प्रत्येक subpopulation का पता चला, एकल - लेबल तनाव का उपयोग नियंत्रण के रूप में है. डबल लेबल तनाव tapa - CFP फ्रैंक, srfAA YFP पी पी फ्लोरोसेंट पत्रकारों के उच्च स्तर व्यक्त कोशिकाओं की दो उप - जनसंख्या का पता चला. प्रत्येक आबादी बनाई है, दिखा रहा है कि वहाँ विशेष 15 कोशिकाओं के दो उप - जनसंख्या के बीच पत्रकारों की अभिव्यक्ति में कोई ओवरलैप है. इसी तरह, प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग डबल लेबल तनाव SKF-YFP, tapa - YFP पी पी 10 में आंकड़ा प्रस्तुत किया है. जीन SKF के लिए रिपोर्टर 32 नरभक्षी, जो मैट्रिक्स 24 उत्पादकों की subpopulation के साथ coordinately अंतर वर्णित किया गया है subpopulation का भेदभाव पर नज़र रखता है. इस मामले में, डबल लेबल तनाव फ्लोरोसेंट व्यक्त कोशिकाओं दोनों YFP और CFP की एक एकल subpopulation दिखाया. यह संकेत दिया कि दोनों सेल भेदभाव रास्ते coordinately से ही subpopulation में सक्रिय हैं.

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आकृति 1. प्रयोग की समग्र योजना. प्रोटोकॉल तीन मुख्य चरणों में विभाजित है. पहला कदम बी के तनाव लेबलिंग की आवश्यकता संवाददाता संलयन है कि ब्याज की subpopulation पर नज़र रखता के साथ subtilis. दूसरा, biofilm से उत्प्रेरण की स्थिति में लेबल उपभेदों बढ़ती. तीसरा, biofilm फैलाने और बाहर एकल कोशिका जनसंख्या का विश्लेषण प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और प्रवाह cytometry का उपयोग कर ले.

चित्रा 2
चित्रा 2. एकीकरण वेक्टर pKM008 की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. इस वेक्टर को तटस्थ ठिकाना amyE में डबल पुनर्संयोजन द्वारा ब्याज की संवाददाता संलयन एकीकृत. ब्याज (पी tapa) के प्रमोटर प्रतिबंध साइटों EcoRI और HindIII का उपयोग वेक्टर में क्लोन है. तो, CFP जीन की अभिव्यक्ति प्रमोटर पी tapa के नियंत्रण के अधीन है. orientatप्लाज्मिड में जीन आयन एक तीर के रूप में प्रतिनिधित्व किया है.

चित्रा 3
चित्रा 3. एकीकरण pDR183 वेक्टर की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. यह वेक्टर तटस्थ ठिकाना lacA में डबल पुनर्संयोजन द्वारा ब्याज की संवाददाता संलयन एकीकृत. ब्याज (पी tapa - CFP) के विलय प्रतिबंध साइटों EcoRI और BamHI का उपयोग वेक्टर में क्लोन है. प्लाज्मिड में जीन के उन्मुखीकरण के एक तीर के रूप में प्रतिनिधित्व किया है.

चित्रा 4
चित्रा 4. पत्रकारों के एकीकरण के बी के गुणसूत्र में योजना डबल पुनर्संयोजन द्वारा subtilis. (ए) बी. subtilis गुणसूत्र दो तटस्थ loci, amyE और lacA के के biofilm के विकास को प्रभावित किए बिना संवाददाता fusions को एकीकृत है. (बी) बी के जीनोम में प्लाज्मिड एकीकृत डबल पुनर्संयोजन द्वारा subtilis. संवाददाता संलयन एक स्थिर तरीके से तटस्थ बिन्दुपथ में एकीकृत करता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. बी के biofilm गठन तनाव बी bioflm गठन के NCIB3610 subtilis प्रक्रिया 3610 NCIB subtilis जब तीन दिनों के दौरान मध्यम biofilm से उत्प्रेरण MSgg पर 30 से बढ़ रहा है डिग्री सेल्सियस Biofilm के विकास के अनुक्रमिक चित्रों को हर 12H लिया गया.

चित्रा 6
6 चित्रा. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation की विज़ुअलाइज़ेशन बी के एक biofilm से एक नमूना. subtilis पी tapa - लागत और भाड़ा मूल्य तय किया गया था और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत जांच की. प्रतिदीप्ति की 200 एमएसउत्तेजना प्रतिदीप्ति कोशिकाओं के बाकी की तुलना में उच्च उत्सर्जन की कोशिकाओं के एक subpopulation सबूत है. हम मैट्रिक्स उत्पादक कोशिकाओं की subpopulation के रूप में इस subpopulation माना जाता है. पैमाने पर पट्टी 3 माइक्रोन है.

7 चित्रा
7 चित्रा. मैट्रिक्स और प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे निर्माता surfactin उत्पादकों की subpopulation की विज़ुअलाइज़ेशन बी के एक biofilm से नमूना. subtilis tapa CFP पी, पी srfAA YFP डबल लेबल तनाव तय किया गया था और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत जांच की. 250 एमएस सबूत कोशिकाओं के बाकी की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन कोशिकाओं के दो उप - जनसंख्या का एक्सपोजर समय. एक subpopulation YFP व्यक्त की है और यह विशेष रूप से YFP चैनल (झूठी पीले रंग में रंग) का उपयोग कर पता चला था. इस surfactin उत्पादकों के subpopulation है. एक अन्य subpopulation CFP व्यक्त की और यह विशेष रूप से CFP फ्रैंक chann का उपयोग करने का पता चला था एल. यह मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation है. पैमाने पर पट्टी 3 माइक्रोन है.

संख्या 8
संख्या 8. मैट्रिक्स 2 - डी प्रवाह cytometry. का उपयोग निर्माताओं की subpopulation की मात्रा बी की एक biofilm कोशिकाओं से बिखरे subtilis tapa YFP पी प्रवाह cytometry का उपयोग निगरानी की गई. प्रवाह cytometer 50.000 घटनाओं की गिनती और प्रत्येक घटना के लिए प्रतिदीप्ति संकेत नजर रखी थी. गिना कोशिकाओं की संख्या वाई अक्ष पर प्लॉट किए जाते है जबकि YFP संकेत की तीव्रता एक्स अक्ष पर प्लॉट किए जाते है. कोशिकाओं को लेग माध्यम में बड़े हो रहे थे biofilm उत्प्रेरण शर्तों प्राप्त है. कोशिकाओं मध्यम MSgg biofilm से उत्प्रेरण की स्थिति प्राप्त करने में बड़े हो रहे थे. मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation biofilm से उत्प्रेरण की स्थिति में ही differentiates. यह आंकड़ा लोपेज एट अल से अनुकूलित किया गया था. (2009) PNAS, 106 :280-285.

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9 चित्रा. मैट्रिक्स उत्पादकों और surfactin के निर्माता 3 डी प्रवाह cytometry का उपयोग subpopulation की मात्रा निगरानी चैनलों के प्रतिदीप्ति संकेत एक्स (YFP के लिए) अक्ष और y अक्ष के (CFP लिए) में प्रस्तुत कर रहे हैं. Z-अक्ष प्रत्येक रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के उपाय और यह मात्रा निर्धारित है समोच्च isolines के रूप में कागज के हवाई जहाज को सीधा. इस प्रयोग में निगरानी की घटनाओं की संख्या 50.000 घटनाओं था. वाम ऊपरी पैनल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का नियंत्रण नहीं फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन को शरण प्रस्तुत है. सही ऊपरी पैनल YFP प्रतिदीप्ति चैनल (पीले रंग में फंसाया) में surfactin उत्पादकों के subpopulation एक एकल लेबल का तनाव पी srfAA - YFP का उपयोग कर पता लगाता है. वाम नीचे के पैनल में एक एकल लेबल तनाव में पी tapa - CFP फ्रैंक का उपयोग CFP प्रतिदीप्ति चैनल (नीले रंग में फंसाया) में मैट्रिक्स उत्पादकों के subpopulation का पता लगाता है. डबल लेबल तनाव पी tapa </ Em> - CFP फ्रैंक, srfAA YFP पी सही नीचे पैनल में निगरानी रखी जाती है. यह दो उप - जनसंख्या है कि पीले और नीले रंग में तैयार कर रहे हैं दिखाया. यह आंकड़ा लोपेज एट अल से अनुकूलित किया गया था. वंशाणु और विकास (2009) 23 :1631-1638.

10 चित्रा
10 चित्रा. मैट्रिक्स उत्पादकों और 3 - डी प्रवाह cytometry का उपयोग नरभक्षी subpopulation की मात्रा निगरानी चैनलों के प्रतिदीप्ति संकेत एक्स (YFP के लिए) अक्ष और y अक्ष के (CFP लिए) में प्रस्तुत कर रहे हैं. इस प्रयोग में निगरानी की घटनाओं की संख्या 50.000 था. सही ऊपरी पैनल एक एकल लेबल तनाव पी SKF-YFP में YFP प्रतिदीप्ति चैनल (पीले रंग में फंसाया) में नरभक्षी की subpopulation का पता लगाता है. वाम नीचे पैनल CFP प्रतिदीप्ति चैनल एक एकल लेबल तनाव पी tapa CFP में नीले रंग में फंसाया में मैट्रिक्स उत्पादकों के subpopulation का पता लगाता है. घouble लेबल तनाव tapa - CFP फ्रैंक, SKF के YFP पी पी एक्स और वाई axes (हरे रंग में फंसाया) विकर्ण में केवल कोशिकाओं के एक subpopulation दिखाया. इस subpopulation YFP और CFP फ्रैंक चैनल में पाया जाता है क्योंकि यह एक साथ दो संवाददाताओं से व्यक्त किया. लोपेज एट अल जीन, और विकास (2009) 23 :1631-1638.

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Discussion

तथ्य यह है कि बैक्टीरियल समुदायों विशिष्ट माइक्रोबियल 33,34 समुदायों के जीन जटिलता सबूत सेट व्यक्त कोशिकाओं के उप - जनसंख्या दिखा है. यह प्रोटोकॉल है कि ब्याज की किसी भी जीन की अभिव्यक्ति माइक्रोबियल समुदाय के भीतर विशेष कोशिकाओं का एक विशेष subpopulation तक ही सीमित है निर्धारित करने के लिए मदद करनी चाहिए. इन उप - जनसंख्या का विज़ुअलाइज़ेशन नई तकनीकों के विकास की आवश्यकता है, क्योंकि पारंपरिक तरीकों के जीन की अभिव्यक्ति या पूरे माइक्रोबियल समुदाय और माइक्रोबियल समुदाय के भीतर जीन अभिव्यक्ति के उतार चढ़ाव के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण दर जीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर नजर रखने के लिए आम तौर पर याद कर रहे हैं.

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और सेल प्रकार के विश्लेषण के लिए प्रवाह cytometry आदर्श पूरक प्रदान करने के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक का एक संयोजन है कि ब्याज की subpopulation की परिभाषित करेगा. दोनों तकनीकों की सीमाओं उन वें के लिए एक दूसरे से उल्लेख आवश्यक हैई माप की सटीकता की खातिर. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के मामले में, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (और कभी कभी subpopulation का आकार) से संकेत की तीव्रता जोखिम नमूने (सामान्य रूप से के बीच 50 और 200 मिसे) को उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता समय पर निर्भर करता है. लेकिन प्रवाह cytometry के मामले में, बैक्टीरियल कोशिकाओं के छोटे आकार का पता लगाने सीमा और कुछ बैक्टीरिया निगरानी नहीं किया जा सकता है. सेल आकार प्रतिबंध के कारण, प्रतिदीप्ति रिपोर्टर द्वारा उत्सर्जित संकेत पर्याप्त उच्च प्रतिदीप्ति का पता लगाने और ठीक इस वजह से की अनुमति होना चाहिए है, हम कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ संवाददाताओं से व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाने में समस्याओं का अनुभव है. बहरहाल, नए प्रवाह cytometers अब एक और अधिक संवेदनशील पता लगाने सीमा है, जो हमें एक अधिक सटीक ढंग से बैक्टीरिया आबादी पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है के साथ आते हैं. इसके अतिरिक्त, सीमा का पता लगाने में उच्च संवेदनशीलता हमें सेल छँटाई के लिए परख के लिए, की अनुमति देगा कोशिकाओं की subpopulation हम interes रहे हैं अलगटेड और में इस विशेष subpopulation में जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण करना.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम युवा अन्वेषक रिसर्च प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित है, वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय से संक्रामक रोग अनुसंधान के लिए केंद्र (ZINF) से. जुआन सी गार्सिया - Betancur के है वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय के जीवन विज्ञान के स्नातक स्कूल (GSLS) से पीएचडी साथी है.

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एकल कक्ष का विश्लेषण<em> बेसिलस subtilis</em> प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो का उपयोग Biofilms
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Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A.,… More

Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

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