Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Summary

Mikrobiella biofilmer i allmänhet utgörs av distinkta subpopulationer av specialiserade celler. Enkel-cell-analys av dessa underpopulationer kräver användning av fluorescerande reportrar. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera och övervaka flera subpopulationswithin

Abstract

Biofilm formation är en allmän egenskap att nästan alla bakterier ^1-6. När bakterier bilda biofilmen, celler är inneslutna i extracellulär matrix som i huvudsak utgöres av proteiner och exopolysackarider, bland andra faktorer ^7-10. Den mikrobiella innesluten i biofilmen ofta visar differentiering av distinkta subpopulation av specialiserade celler ^11-17. Dessa subpopulationer samexistera och ofta visar rumsliga och tidsmässiga organisation inom biofilmen ^18-21.

Biofilm bildning i Bacillus modellorganism subtilis kräver differentiering av olika subpopulationer av specialiserade celler. Bland dessa är den subpopulation av matrix tillverkare, som är ansvariga för att producera och utsöndra den extracellulära matrisen av biofilmen väsentlig för bildning av biofilm ^11,19. Därför är differentiering av matris producenter ett kännetecken för biofilm bildning i B. subtilis.

Vi har använt fluorescerande reportrar att visualisera och kvantifiera subpopulationen av matrisen producenter i biofilmer av B. subtilis ^15,19,22-24. Konkret har vi observerat att subpopulationen av matrisen producenter skiljer svar på närvaron av egenproducerade extracellulär signal surfaktin ^25. Intressant nog är surfaktin som produceras av en subpopulation av specialiserade celler som skiljer sig från den subpopulation av matrix tillverkare ^15.

Vi har i denna rapport den tekniska lösning som krävs för att visualisera och kvantifiera subpopulationen av matrisen producenter och producenter surfaktin inom biofilmen av B. subtilis. För att göra detta är fluorescerande reportrar av gener som krävs för matrix produktion och surfaktin produktionen in i kromosomen av B. subtilis. Reportrar uttrycks endast i en subpopulation av specialiserade celler. Därefter kan de vara subpopulationerövervakades med användning av fluorescens-mikroskopi och flödescytometri (se fig. 1).

Det faktum att olika subpopulationer av specialiserade celler samexisterar inom flercelliga grupper av bakterier ger oss ett annat perspektiv om regleringen av genuttryck i prokaryoter. Detta protokoll behandlar detta fenomen experimentellt och kan enkelt anpassas till en annan arbetsmodell, för att belysa de molekylära mekanismerna bakom fenotypisk heterogenitet inom en mikrobiell gemenskap.

Protocol

1. Märkning B. subtilis och biofilmbildning Assay

1. Amplifiera genom PCR-promotorregionen hos genen av intresse. Vi visar som exempel kloning av P _tapa, promotorn av generna som är ansvariga för produktion av Tasa matrixprotein ^26. Klon P _tapa i pkm008 vektor (som skapats av Rudner labbet, Harvard Medical School. Boston, USA) (Fig. 2).
2. Linjärisera plasmiderna genom enzymatisk digerering (Enzyme rekommenderade, Xhol).
3. Inducerar naturlig kompetens i B. subtilis stam 168 genom att följa det en-stegs protokoll som tidigare beskrivits av Harwood och Cutting ^27.
4. Tillsätt de linjäriserade plasmider in i kultur av kompetenta celler och selektera för spektinomycinresistens efter två timmars inkubation.
5. Erhållna stammar har satt in konstruktionen i den neutrala amyE platsen för B. subtilis genom att dubbelklicka rekombination (fig 4). För att skapaen dubbel-märkt stam, integrera den andra reportern till neutralläget locuset Laca genom användning av plasmiden pDR183 vi presenterar i figur 3. Sätt in denna reporter med samma teknik som vi beskrivit ovan för införande av reportrar som klonats i pKM008.
6. Överföra rapportören från stam 168 till NCIB3610 som är i stånd att bilda biofilmen. Använd SPP1 fagtransduktion protokollet ^28,29. Växa donator stam i TY medium (LB +10 mm MgSO ₄ +10 M MnSO _4). Blanda 200 | il av kulturen med 100 pl av fagstocken utspädning. Tillsätt 3 ml mjuk agar efter 30 minuters inkubation och låt fag halo kan uppstå vid 37 ° C.
7. Uppsamling av mjuk agar. Centrifugera den och passera supernatanten trodde en spruta 0,22 m filter. Använda denna supernatant för att infektera en kultur av mottagaren stam odlades i TY-medium. Tillsätt 30 pl till 10 ml av kulturen späddes 1:10. Inkubera under 30 min och selektera för resistens mot antibiotika efter 24 timmars inkubering.
8. Seavmarkerar en koloni och växa över natten på LB vid 37 ° C.
9. Upptäcka 3 | il av den resulterande kulturen på fast biofilmen-inducerande mediet MSgg 1,5% agar ^30. Tillåta cellerna att växa under 72 timmar vid 30 ° C (figur 3). Efter tre dagars tillväxt, som utvecklats biofilmer som bildas på ytan av den MSgg agar en komplex morfologisk struktur på ytan av agaren.

2. Biofilm Dispersion och Cell Fixation

1. Avlägsna biofilm formen på ytan av MSgg agar med användning av en tandpetare eller pincett. Samstämmigheten i biofilmen gör att du kan att skala bort det från ytan av agar i ett stycke.
2. Placera biofilmen i 3 ml PBS-buffert och dispergera biofilmen genom upprepad passage genom en pipett eller en nål. Alternativt kan biofilm spridning göras med hjälp av mild ultraljudsbehandling. Mild ultraljudsbehandling kräver 12 pulser med en effekt på 3 och amplitud på 0,7 sekunder.
3. Fix proverna före cell-enda analys. Resuspend 300 ^ il av cellsuspensionen i 1 ml 4% paraformaldehyd-lösning och inkubera vid rumstemperatur under exakt sju minuter.
   Sammansättningen av 4% paraformaldehyd-lösning:
   2 g paraformaldehyd
   50 ml PBS-buffert
   4 | il 10 N NaOH
   Filtrera lösningen genom ett 0,22 um filter och alikvot
4. Tvätta cellerna efter fixering i PBS-buffert tre gånger och återsuspendera dem i 300 | il PBS-buffert.

3. Fluorescensmikroskopi

1. Häll 200 pl 0,8% agaros över en objektglas och försiktigt täck den med en annan bild. Ta bort den övre bilden mjukt efter 2 minuter för att uppnå ett lager av agaros fäst till bilden av botten.
2. Spot 2 pl fasta celler på ytan av agarosen lagret och täck den med ett mikroskop täckglas.
3. Placera provet i fluorescensmikroskop. Vi använder ett fluorescensmikroskop Leica DMI6000B utrustad med en Leica CRT6000 iIlumination system. Filtren för YFP är Ex: BP500/20, Em: BP535/30 och gemensamma fiskeripolitiken är Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Exponera ditt prov en exciteringskod fluorescens mellan 50-200 ms. Ställa in excitations-period enligt en negativ kontroll som visar ingen fluorescens i de valda betingelserna för försöket.
5. Se fluorescensen bilden till samma bild som erhålls med ljust fält. Slå ihop de två bilderna i en bild. Resultaten erhölls från flödet fluorescensmikroskopi med användning av en enkel-märkt stam härbärgerande reportern P _TAPA-YFP är representerade i figur 6.

4. Kvantifiering av enskilda celler med användning av flödescytometri

1. Dispergera provet fasta celler med användning mild sonikering. Sonikera provet utföra 2 rad 12 pulser med en utsignal av 5 och amplitud av 0,7 sekunder, för att dispergera klumpar till enskilda celler utan att orsaka cellys. Bekräfta effektiviteten hos cellen dispersion genom Ijusmikroskopi. Spädda provet 1:100 i PBS-buffert före flödescytometrisk analys. Vi använder en flödescytometer BD FACS Canto II. För YFP fluorescens, använd en laser excitation vid 488 nm tillsammans med en 530/30 filter. För den gemensamma fiskeripolitiken fluorescens, använd laserexcitation vid 405 nm tillsammans med en 408/40 filter.
2. Kalibrera maskinen flödescytometer med två negativa kontroller. Ett prov av PBS-buffert utan celler i suspension bör tjäna som negativ kontroll för storleken hos de partiklar som detekteras av flödescytometern. Ett prov märktes med ingen fluorescens reporter bör tjäna som negativ kontroll för fluorescens känslighet flödescytometer.
3. Placera provet märktes med fluorescerande reporter i flödescytometern. För varje prov, analysera minst 50.000 händelser med ett flöde mellan 300 och 3000 händelser per sekund.
4. Fånga data med hjälp av FACS Diva programvara (BD Biosciences) och analysera den med hjälp FlowJo 8.5.2 programvara. Se fluorescens signaler till den kontroll som visaringen fluorescens.
5. Presentera data för övervakning av fluorescens-signalen av en enda märkt stam med en tvåaxlig grafisk. Plotta fluorescens-signalen detekteras i X-axeln och antalet celler som uttrycker de olika nivåerna av fluorescens i Y-axeln. Resultaten erhölls från flödescytometrianalys med användning av en enkel-märkt stam härbärgerande reportern P _TAPA-YFP är representerade i figur 8.
6. Presentera data för övervakning av fluorescens-signalen av en dubbel-märkt stam med en tre-axlig grafisk. Plotta fluorescens-signalen i var och en av kanalerna som övervakas i X-och Y-axlar (till exempel, skulle GFP mätas i X-axeln och GFP i den Y-axeln). Plot i Z-axeln antalet celler som uttrycker varje reporter och presentera dem som konturen isolines som skulle vara vinkelrät mot papperets plan (fig 9 och 10).

4. Representativa resultat

När B. subtilis växer på en tallrik av biofilm-inducerande mediet MSgg, biofilmbildning observeras efter tre dagars inkubation vid 30 ° C ^30. Biofilmen visar stark konsistens och den kan skalas av från ytan av agar i ett stycke. Dessutom visar biofilm en komplex morfologisk arkitektur som vittnar om de distinkta deltagande cellsubpopulationer (Fig. 5). Till exempel produktion av extracellulär matrix i biofilmer resulterar i bildning av rynkor på ytan av kolonin. Denna funktion kan korreleras med differentiering av subpopulationen av matrisen producenter ^19. På liknande sätt är en höjning av antenn strukturer på ytan av biofilmen indikerar närvaron av en subpopulation av sporulerande celler, eftersom sporerna lokaliserad i den apikala området av dessa strukturer ^30.

Exempel på visualisering av celldifferentiering i en enkel-märkta och en dubbel-märkt stam med användning av fluorescensmikroskopi är represented i figur 6 och 7, respektive. En-märkt stam härbärgerar den fluorescerande reportergruppen P _TAPA-GFP som uttryckes i den subpopulationen av matrix-producerande celler. Denna subpopulation är ansvarig för att producera och utsöndra den extracellulära matrisen som utgör biofilmen (fig. 6). Den dubbel-märkta stammen hyser reportern P _{tapa-fiskeripolitiken} ²⁶ och ytterligare reporter P _srfAA-YFP ^31. Denna andra reportern tillåter att övervaka subpopulation av celler som är ansvariga för utsöndring av den signalerande molekylen surfaktin, som triggar den signalerande kaskaden till differentieringen av matrispartiklarna tillverkarna (fig. 7). Subpopulation av matris producenter är falska färgade i blått, medan subpopulation av surfaktin tillverkare är falskt färgad i gult.

Flödescytometrianalys med användning av en enkel-märkt stam härbärgerande reportern P _TAPA-YFP visas i figur 8. Obehandlad kontroll stam hyser intealla fluorescerande proteingener visade en enda population låg relativ fluorescens. Celler som härbärgerar P _tapa-YFP i icke biofilm-inducerande förhållanden inte differentiera subpopulation av matrisen producenter och hela befolkningen visade låg relativ fluorescens. I biofilmen-inducerande tillstånd, inträffade en subpopulation av celler med hög relativ fluorescens, observerades som en skuldra eller till höger om den låga relativa fluorescensen topp ^23.

Resultaten erhållna från flödescytometrianalys med användning av en dubbel-märkt stam är representerade i figur 9 och 10. Figur 9 övervakade de delpopulationer av matrix producenter och producenter surfaktin med hjälp av dubbel-märkta stammen P _tapa-GFP P _srfAA-YFP. Som kontroll av bakgrundsfluorescens använde vi en stam som inte hyser några fluorescerande protein gener. Därefter upptäckte vi varje subpopulation av matris producenter och producenter surfaktin i varje fluorescens kanal, använder enkel-märkt stam s som kontroller. Den dubbel-märkta stammen P _TAPA-GFP, P _srfAA-YFP visade två subpopulationer av celler som uttrycker höga nivåer av de fluorescerande reportrar. Varje population är inramad, som visar att det inte finns någon överlappning i uttrycket av reportrarna mellan de två subpopulationer av specialiserade celler ^15. På liknande sätt flödescytometrianalys med användning av dubbel-märkt stam P _SKF-YFP, P _TAPA-YFP visas i figur 10. Rapportörgenen för genen SKF övervakar differentiering av subpopulationen av kannibaler ^32, vilken har beskrivits för att differentiera koordinerat med den subpopulation av matrix tillverkare ^24. I detta fall visade den dubbel-märkta stammen en enda subpopulation av fluorescerande celler som uttrycker både YFP och GFP. Detta visade att båda cell differentiering vägarna koordinerat aktiveras i samma subpopulation.

1.jpg "/>
Figur 1. Övergripande system av försöket. Protokollet är indelad i tre steg. Det första steget kräver märkning av stam av B. subtilis med reportern fusion som övervakar subpopulationen av intresse. För det andra växer märkta stammar i biofilm-inducerande förhållanden. Tredje, dispergera biofilmen och utföra encelliga analys av populationen med användning av fluorescens-mikroskop och flödescytometri.

Figur 2. Schematisk representation av integrationsvektorn pKM008. Denna vektor integrerar reportern fusion av intresse in i det neutrala stället amyE genom dubbel rekombination. Arrangören av intresse (P _tapa) klonas in i vektorn med hjälp av restriktionsställena EcoRI och Hindlll. Sedan är ett uttryck för den gemensamma fiskeripolitiken genen under kontroll av promotorn P _tapa. Den orientatjon av generna i plasmiden representeras som en pil.

Figur 3. Schematisk representation av integrationsvektorn pDR183. Denna vektor integrerar reportern fusion av intresse in i det neutrala stället Laca genom dubbel rekombination. Fusion av intresse (P _tapa - GFP) klonas in i vektorn med användning av restriktionsställena EcoRI och BamHI. Orienteringen av generna i plasmiden representeras som en pil.

Figur 4. Ordning med en integrering av reportrarna i kromosomen hos B. subtilis genom att dubbelklicka rekombination. (A) B subtilis-kromosomen har två neutrala loci, amyE och Laca, för att integrera reporter fusioner utan att påverka utvecklingen av biofilm. (B) B. subtilis genom att dubbelklicka rekombination. Reportern sammansmältning integrerar in i neutralläge lokus på ett stabilt sätt.

Figur 5. Biofilmbildning av B. subtilis NCIB3610. Processen för bioflm bildandet av stammen B. subtilis NCIB 3610 då växer på biofilmen-inducerande medel MSgg under tre dagar vid 30 ° C. Sekventiella bilder av utvecklingen av biofilm togs varje 12h.

Figur 6. Visualisering av subpopulationen av matrix tillverkare under fluorescensmikroskop. Ett prov från en biofilm av B. subtilis P _tapa - gemensamma fiskeripolitiken fastställdes och undersöktes under fluorescensmikroskop. 200 ms av fluorescensexcitering framgår en subpopulation av celler som avger högre fluorescens än resten av cellerna. Vi det här subpopulationen som subpopulation av matris-producerande celler. Skalstrecket är 3 | im.

Figur 7. Visualisering av subpopulationen av matrix tillverkare och surfaktin under fluorescensmikroskop. Prov från en biofilm av B. subtilis P _tapa-GFP P _srfAA-YFP dubbel-märkta stammen fastställdes och undersöktes under fluorescensmikroskop. Exponeringstid av 250 framgår ms två subpopulationer av celler som avger högre fluorescens än resten av cellerna. En subpopulation uttryckte YFP och det upptäcktes att enbart använda sig av YFP kanal (falskt färgad i gult). Detta är den subpopulation av surfaktin tillverkare. En annan subpopulation uttryckte GFP och det var enbart upptäcktes med hjälp av GFP chann el. Detta är den subpopulation av matrix tillverkare. Skalstrecket är 3 | im.

Figur 8. Kvantifiering av subpopulationen av matrisen producenter som använder 2-D flödescytometri. Spritt celler från en biofilm av B. subtilis P _TAPA-YFP övervakades med användning av flödescytometri. Flödescytometern räknade 50.000 händelser och fluorescenssignalen för varje evenemang övervakades. Antalet räknade celler är avsatt i Y-axeln under det att intensiteten för YFP-signalen plottas på X-axeln. Cellerna odlades i LB-medium för att erhålla icke-biofilmen inducerande betingelser. Cellerna odlades i MSgg medium för att erhålla biofilmen-inducerande betingelser. Den subpopulation av matris producenter skiljer bara i biofilm-inducerande förhållanden. Denna figur var anpassad från Lopez et al., PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
Figur 9. Kvantifiering av subpopulationen av matrix tillverkare och surfaktin som använder 3-D-flödescytometri. Fluorescenssignalen av de övervakade kanaler presenteras i X-axeln (för YFP) och Y-axeln (för GFP). Z-axeln mäter antalet celler som uttrycker varje reporter och det kvantifieras som konturen isolines vinkelräta mot planet för papperet. Antalet händelser som övervakas i detta experiment var 50,000 händelser. Övre vänstra panelen visar en kontroll av bakgrundsfluorescens hysa några fluorescerande protein gener. Övre högra panelen upptäcker subpopulation av surfaktin producenter i YFP fluorescensen kanal (inramade i gult) med en enkel-märkt stam P _srfAA-YFP. Nedre vänstra panelen upptäcker subpopulation av matrisen producenter i den gemensamma fiskeripolitiken fluorescensen kanal (inramat i blått) med en enkel-märkt stam P _{tapa-gemensamma} fiskeripolitiken. Den dubbel-märkta stammen P _tapa </ Em>-GFP P _srfAA-YFP övervakas i det högra nedre panelen. Det visade två subpopulationer som inramade i gult och blått. Denna siffra var anpassad från López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Figur 10. Kvantifiering av subpopulationen av matrix tillverkare och kannibaler användning av 3-D-flödescytometri. Fluorescenssignalen av de övervakade kanaler presenteras i X-axeln (för YFP) och Y-axeln (för GFP). Antalet händelser som övervakas i detta experiment var 50,000. Övre högra panelen upptäcker subpopulation av kannibaler i YFP fluorescensen kanal (inramade i gult) i en enda märkt stam P _SKF-YFP. Nedre vänstra panelen upptäcker subpopulation av matrisen producenter i den gemensamma fiskeripolitiken fluorescensen kanal (inramat i blått) i en enda märkt stam P _{tapa-gemensamma} fiskeripolitiken. I double-märkt stam P _TAPA-GFP, P _SKF-YFP visade endast en subpopulation av celler i diagonal till X-och Y-axlarna (inramade i grönt). Denna subpopulation detekteras i YFP och den gemensamma fiskeripolitiken kanalen eftersom den uttrycker de två reportrarna samtidigt. Lopez et al, Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Discussion

Det faktum att bakteriella samhällen visar subpopulationer av celler som uttrycker viss uppsättning av gener bevis komplexiteten i mikrobiella samhällen ^33,34. Detta protokoll bör hjälpa till att bestämma huruvida expressionen av varje gen av intresse är begränsad till en särskild underpopulation av specialiserade celler inom den mikrobiella. Visualisering av dessa subpopulationer kräver utveckling av nya tekniker, eftersom traditionella metoder för att övervaka genuttryck eller microarray analys takt nivåerna av genuttryck för hela mikrobiella samhället och fluktuationer i genuttryck i den mikrobiella samhället i allmänhet missas.

Fluorescensmikroskopi och flödescytometri komplement idealt för analys av celltyper för att ge en kombination av kvalitativ och kvantitativ som kommer att definiera den subpopulation av intresse. Begränsningar av båda teknikerna gör dem nödvändigt att hänvisa till varandra för the skull noggrannhet mätningarna. I fallet med fluorescensmikroskopi, varierar intensiteten hos signalen från fluorescerande celler (och ibland storleken på subpopulationen) beroende på exponeringstid används för att excitera de prover (normalt mellan 50 och 200 ms). I fallet med den flödescytometri begränsar emellertid den ringa storleken hos de bakteriella cellerna detektering och vissa bakteriella kan inte övervakas. På grund av begränsningar cellstorlek, bör den fluorescerande signalen som utsänds av reportern vara tillräckligt hög för att tillåta detektering av fluorescens och, just på grund av detta har vi erfarit problem vid detektion av celler som uttrycker reportrar med låg expressionsnivå. Men nya flödescytometrar kommer nu med en mer känslig detektionsgräns, vilket tillåter oss att övervaka bakteriella populationer på ett mer exakt sätt. Dessutom kommer den högre känsligheten vid detektion gräns tillåter oss att analysera med avseende cellsortering, att isolera den subpopulation av celler vi interesTed i och genomför analyser genuttryck i detta subpopulation.