מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Summary

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin כמה

Abstract

היווצרות biofilm היא תכונה כללית כמעט כל ^1-6 חיידקים. כאשר חיידקים ליצור biofilms, תאים נארזים תאי מטריקס כי היא היוותה בעיקר על ידי חלבונים exopolysaccharides, בין היתר ^7-10. קהילת חיידקים עטוף בתוך biofilm לעיתים קרובות ניתן לראות את הבידול של subpopulation מובהק של תאים מיוחדים ^11-17. Subpopulations אלה לדור בכפיפה אחת, ולעתים קרובות להראות ארגון במרחב ובזמן בתוך biofilm ^18-21.

היווצרות biofilm ב האורגניזם subtilis מודל בצילוס דורש בידול של subpopulations שונים של תאים מיוחדים. ביניהם, subpopulation של מפיקי מטריקס, אחראי לייצר ולהפריש תאי מטריקס של biofilm הוא חיוני ליצירת biofilm ^11,19. לפיכך, בידול של מפיקי מטריקס היא סימן ההיכר של היווצרות biofilm ב B. subtilis.

השתמשנו כתבים ניאון כדי לחזות ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ב biofilms של B. subtilis ^15,19,22-24. באופן קונקרטי, יש לנו ציין כי subpopulation של מפיקי מטריקס מבדיל בתגובה לנוכחות של האות בהפקה עצמית תאי surfactin ^25. מעניין, surfactin מופק על ידי subpopulation של תאים מיוחדים שונים subpopulation של מפיקי מטריקס ^15.

הפרדנו בדוח זה גישה טכנית צורך לדמיין ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin בתוך biofilms של subtilis ב. לשם כך, כתבים ניאון של הגנים הדרושים לייצור מטריקס ייצור surfactin מוכנסים לתוך כרומוזום של B. subtilis. עיתונאים באים לידי ביטוי רק subpopulation של תאים מיוחדים. לאחר מכן, subpopulations יכולים להיותמעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry זרימה (ראה איור 1).

העובדה subpopulations שונים של תאים מיוחדים לדור בכפיפה אחת בתוך הקהילות תאיים של חיידקים נותן לנו נקודת מבט שונה על רגולציה של ביטוי גנים פרוקריוטים. פרוטוקול זה מטפל בתופעה בניסוי וניתן להתאים בקלות כל מודל עבודה אחר, כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההטרוגניות פנוטיפי בתוך קהילה של חיידקים.

Protocol

1. סימון ב ' subtilis היווצרות assay biofilm

1. להגביר ידי PCR את האזור המקדם של הגן של עניין. אנחנו מראים כדוגמא שיבוט של P _טאפה, האמרגן של הגנים האחראים על ייצור של חלבון מטריקס טסה ^26. Clone P _טאפה לתוך וקטור pkm008 (שנוצר על ידי המעבדה רודנר, מבית הספר לרפואה הארוורד. בוסטון, ארה"ב) (איור 2).
2. Linearize את פלסמידים על ידי עיכול אנזימטי (אנזים המומלצת, XhoI).
3. יכולת לגרום טבעי ב subtilis להתאמץ 168 על ידי ביצוע הפרוטוקול צעד אחד שתואר בעבר על ידי Harwood חיתוך ^27.
4. מוסיפים את פלסמידים לינארית לתוך התרבות של תאים המוסמכות ובחר להתנגדות spectinomycin לאחר שעתיים של הדגירה.
5. זנים שהתקבלו הכנסת את המבנה לתוך לוקוס amyE נייטרלי ב ' subtilis על ידי רקומבינציה כפולה (איור 4). כדי ליצורזן פעמיים שכותרתו, לשלב את הכתב 2 לתוך lacA לוקוס ניטרלי באמצעות פלסמיד pDR183 אנו מציגים באיור 3. הכנס את הכתב תוך שימוש בטכניקה אותה תיארנו לעיל את הכניסה של עיתונאים משובטים ב pKM008.
6. להעביר את כתב מתח 168 ל NCIB3610 כי הוא מסוגל ליצור biofilms. השתמש התמרה הפאג SPP1 פרוטוקול ^28,29. לגדל זן תורם ב TY בינוני (LB +10 +10 מ"מ MgSO ₄ מיקרומטר MnSO _4). מערבבים 200 μl של תרבות עם 100 μl של דילול המניות הפאג. הוסף 3 מ"ל של אגר רך לאחר 30 דקות של הדגירה ולאפשר הילות הפאג לעלות על 37 ° C.
7. איסוף אגר רך. סרכזת אותו ולהעביר supernatant חשבתי 0.22 מיקרומטר מזרק הסינון. השתמש supernatant להדביק תרבות של זן הנמען גדל במדיום TY. הוסף 30 μl עד 10 מ"ל של 1:10 תרבות בדילול. דגירה למשך 30 דקות ולבחור את עמידות לאנטיביוטיקה לאחר 24 שעות של דגירה.
8. Select המושבה לגדל אותו לילה על LB ב 37 ° C.
9. לזהות 3 μL של תרבות הלילה ב-בינוני biofilm התרמה מוצק MSgg אגר 1.5% ^30. לאפשר לתאים לגדול במהלך 72 שעות ב 30 ° C (איור 3). אחרי שלושה ימים של צמיחה, biofilms נוצרו על פני השטח של אגר MSgg פיתחה ארכיטקטורה מורכבת מורפולוגית פני השטח של אגר.

2. Biofilm פיזור קיבוע נייד

1. הסר את הטופס biofilm את פני השטח של אגר MSgg באמצעות קיסם או פינצטה. העקביות של biofilm יאפשר לך לקלף אותו מפני השטח של אגר בחתיכה אחת.
2. מניחים את biofilm ב 3 מ"ל של PBS חיץ ולפזר biofilm על ידי מעבר חוזר על עצמו באמצעות פיפטה או מחט. לחילופין, פיזור biofilm ניתן לעשות זאת באמצעות sonication קלה. Sonication קלה דורש 12 פולסים עם תפוקה של 3 ו המשרעת של 0.7 שניות.
3. תיקון ניתוח דגימות תאים לפני אחת. Resuspenד 300 μL ההשעיה תא 1 מ"ל של תמיסת paraformaldehyde 4% ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות בדיוק.
   הרכב הפתרון paraformaldehyde 4%:
   2 גרם של paraformaldehyde
   50 מ"ל של PBS חיץ
   4 μl 10 N NaOH
   לסנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 aliquot אום
4. לשטוף את התאים לאחר קיבוע ב PBS חיץ שלוש פעמים resuspend אותם μL 300 מאגר PBS.

3. הקרינה מיקרוסקופית

1. יוצקים 200 μL של 0.8% agarose על שקופיות מיקרוסקופ ובזהירות לכסות את זה עם שקופיות אחר. להסיר את השקופית העליונה בשקט אחרי 2 דקות כדי לקבל שכבה של agarose מצורף לשקופית של הקרקעית.
2. 2 במקום μL של תאים קבוע על פני השטח של שכבת agarose ולכסות אותו עם כוס כיסוי מיקרוסקופ.
3. מניחים את הדוגמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו משתמשים מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica DMI6000B מצויד CRT6000 Leica iIluminatיון המערכת. את המסננים עבור YFP הם Ex: BP500/20, ארן: BP535/30 ועל CFP הם Ex: BP426/20, ארן: 480/40
4. לחשוף את המדגם שלך על הקרינה עירור בין 50-200 MS. הגדר את תקופת עירור על פי השליטה שלילית אשר מראה לא הקרינה את התנאים שנבחרו לניסוי.
5. להפנות את התמונה הקרינה לתמונה אותה קיבל עם שדה בהיר. למזג את שתי התמונות לתמונה אחת. לתוצאות שהתקבלו במיקרוסקופ זרימת הקרינה באמצעות מתח יחיד הנקרא מחסה כתב P _טאפה-YFP מיוצגים באיור 6.

4. כימות של תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה

1. לפזר את דגימת תאים קבוע באמצעות sonication קלה. Sonicate מדגם ביצוע 2 סדרות של 12 פעימות עם תפוקה של 5 ו המשרעת של 0.7 שניות, לפזר גושים לתוך תאים בודדים מבלי לגרום תמוגה התא. לאשר את היעילות של פיזור תאים על ידי מיקרוסקופ אור. לדלל מדגם 1:100 במאגר PBS לפני ניתוח cytometry הזרימה. אנו משתמשים cytometer זרימת BD FACS קנטו II. עבור YFP פלואורסצנטי, השתמש עירור לייזר ב 488 ננומטר יחד עם 530/30 המסנן. עבור CFP פלואורסצנטי, השתמש עירור לייזר ב 405 ננומטר יחד עם 408/40 המסנן.
2. לכייל את המכונה cytometer לזרום עם שני פקדים שליליות. מדגם של חיץ PBS ללא התאים בתרחיף צריכה לשמש שליטה שלילית עבור גודל החלקיקים חש ידי cytometer את הזרימה. לדוגמה תווית עם כתב לא הקרינה יש לשמש בקרת שלילית על הרגישות הקרינה של cytometer את הזרימה.
3. מניחים את המדגם תווית עם כתב ניאון ב cytometer את הזרימה. עבור מדגם זה, לנתח לפחות 50,000 אירועים עם קצב הזרימה בין 300 ל 3000 אירועים בשנייה.
4. לכידת נתונים באמצעות FACS דיווה תוכנה (BD Biosciences) ולנתח אותו באמצעות FlowJo 8.5.2 התוכנה. עיין אותות הקרינה לשליטה להראות כישום פלואורסצנטי.
5. להציג את נתוני ניטור אותות הקרינה של זן יחיד מסומן שני צירים גרפי. לתכנן את האות הקרינה לאתר בציר X ו את מספר התאים המבטאים רמות שונות של הקרינה בציר Y. תוצאות ניתוח תזרים cytometry באמצעות מתח יחיד הנקרא מחסה כתב P _טאפה-YFP מיוצגים באיור 8.
6. להציג את נתוני ניטור אותות הקרינה של זן פעמיים מסומנים שלושה צירים גרפי. לתכנן את האות הקרינה של כל אחד מערוצי פיקוח על צירי X ו-Y (לדוגמה, GFP יהיה למדוד ציר ה-X ו CFP על ציר ה-Y). מגרש Z-ציר את מספר התאים המבטאים כל אחד כתב ולהציג אותם isolines מתאר זה יהיה בניצב למישור של העיתון (איור 9 ו 10).

4. נציג תוצאות

כאשר ב subtilis גדל על צלחת של Biofilm-התרמה MSgg בינוני, היווצרות biofilm הוא ציין לאחר שלושה ימים של דגירה על 30 ° C ^30. Biofilm מראה עקביות חזקה וזה יכול להיות קילף מפני השטח של אגר בחתיכה אחת. יתר על כן, biofilm מראה אדריכלות מורפולוגית מורכבת מעיד על subpopulations שונים תאים המשתתפים (איור 5). למשל, ייצור של מטריקס תאיים בתוצאות biofilms היווצרות של קמטים על פני השטח של המושבה. תכונה זו יכולה להיות מתואם עם בידול של subpopulation של מפיקי מטריקס ^19. כמו כן, העלאת מבנים אוויר על פני השטח של biofilm מעיד על נוכחות של subpopulation של תאים sporulating, שכן הנבגים מקומי באזור הפסגה של מבנים אלה ^30.

דוגמאות להדמיה של התמיינות תאים של יחיד שכותרתו זן פעמיים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הן represented באיור 6 ו -7, בהתאמה. זן יחיד שכותרתו מטפח כתב ניאון P _טאפה-CFP זה בא לידי ביטוי subpopulation של תאים המייצרים מטריקס. Subpopulation זו אחראית לייצר ולהפריש תאי מטריקס המהווה biofilm (איור 6). זן פעמיים שכותרתו מטפח את הכתב P _טאפה-CFP ²⁶ ואת הכתב נוסף _srfAA P-YFP ^31. זה הכתב 2 מאפשר לעקוב אחר subpopulation של תאים האחראים להפריש surfactin מולקולת האיתות, אשר מפעילה את מפל איתות בידול המפיקים מטריקס (איור 7). Subpopulation של מפיקי מטריקס שקריות בצבע בכחול בעוד subpopulation של יצרנים surfactin היא שקרית בצבע צהוב.

Cytometry זרימה ניתוח באמצעות מתח יחיד הנקרא מחסה כתב P _טאפה-YFP מוצג באיור 8. זן קבוצת הביקורת לא מחסהכל גן חלבון פלואורסצנטי הראה אוכלוסייה אחת הקרינה נמוכה יחסית. תאים מחסה P _טאפה-YFP ב biofilm וישכנע התנאים הלא לא הבדילו subpopulation של מפיקי מטריקס לבין האוכלוסייה כולה הראו הקרינה יחסית נמוכה. במצב biofilm-התרמה, subpopulation של תאים עם הקרינה היחסית גבוהה עלה, נצפתה כמו כתף ימין של שיא הקרינה נמוכה יחסית ^23.

התוצאות שהתקבלו מניתוח תזרים cytometry באמצעות זן פעמיים שכותרתו מיוצגים באיור 9 ו 10. איור 9 פיקוח על subpopulations של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin באמצעות זן פעמיים שכותרתו P _{טאפה-CFP, P-srfAA} YFP. כמו השליטה על הקרינה רקע השתמשנו זן לא מסתיר שום גנים חלבון פלואורסצנטי. לאחר מכן, הבחנו בכל subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin בערוץ כל הקרינה, באמצעות מתח יחיד הנקרא זה כמו פקדי. זן פעמיים שכותרתו P _{טאפה-CFP, P-srfAA} YFP הראה שני subpopulations של תאים המבטאים רמות גבוהות של הכתבים ניאון. כל האוכלוסייה ממוסגר, מראה כי אין חפיפה בביטוי הכתבים בין שתי subpopulations של תאים מיוחדים ^15. באופן דומה, באמצעות ניתוח תזרים cytometry פעמיים שכותרתו זן _P-SKF YFP, _P-טאפה YFP מוצגת באיור 10. כתב של SKF הגן מפקח על בידול של subpopulation ³² קניבלים, אשר תוארה להבדיל מתואמת עם subpopulation של מפיקי מטריקס ^24. במקרה זה, את המתח פעמיים שכותרתו הראה subpopulation אחת של תאים ניאון המבטאים הן YFP ו CFP. זה היה רמז לכך הן בידול מסלולים סלולריים מופעלים בצורה מתואמת subpopulation אותו דבר.

1.jpg "/>
באיור 1. התוכנית הכוללת של הניסוי. פרוטוקול מחולק לשלושה שלבים עיקריים. הצעד הראשון מחייב תיוג של זן ב ' subtilis במיזוג כתב המנטרת subpopulation של עניין. שנית, גדלים זנים המסומנים ב biofilm וישכנע תנאים. שלישית, לפזר את biofilm ולבצע מתא בודד ניתוח של האוכלוסייה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry הזרימה.

איור 2. ייצוג סכמטי של pKM008 וקטור אינטגרציה. וקטור זה משלב היתוך הכתב עניין לתוך amyE לוקוס ניטרלי ידי רקומבינציה כפולה. האמרגן של עניין (P _טאפה) הוא משובטים לתוך וקטור באמצעות אתרי הגבלה EcoRI ו HindIII. אם כן, הביטוי של הגן CFP היא בשליטת היזם P _טאפה. Orientatיון של הגנים פלסמיד מיוצג כחץ.

איור 3. ייצוג סכמטי של וקטור שילוב pDR183. וקטור זה משלב היתוך הכתב עניין לתוך נייטרלי לוקוס lacA ידי רקומבינציה כפולה. היתוך מעניין (P _טאפה - CFP) הוא משובטים לתוך וקטור באמצעות אתרי הגבלה EcoRI ו BamHI. האוריינטציה של הגנים פלסמיד מיוצג כחץ.

באיור 4. תוכנית האינטגרציה של הכתבים לתוך כרומוזום של B. subtilis על ידי רקומבינציה כפולה. (א) ב ' כרומוזום subtilis שני לוקוסים נייטרלי, amyE ו lacA, לשלב fusions הכתב מבלי להשפיע על הפיתוח של biofilm. (ב ') ב ' subtilis על ידי רקומבינציה כפולה. היתוך הכתב משתלב לוקוס ניטרלי באופן יציב.

איור 5. Biofilm היווצרות ב ' subtilis NCIB3610. תהליך של היווצרות bioflm של זן ב ' subtilis NCIB 3610 כאשר גדל על MSgg biofilm-התרמה בינוני במהלך שלושה ימים ב 30 מעלות ג תמונות ברצף של התפתחות biofilm נלקחו כל 12 שעות.

איור 6. ויזואליזציה של subpopulation של מפיקי מטריקס תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדגם biofilm ב ' subtilis P _טאפה - CFP נקבע ובחן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. 200 ms של הקרינהעירור עדות subpopulation של תאים הפולטים הקרינה גבוהה יותר משאר התאים. ראינו בכך subpopulation כמו subpopulation של מטריקס תאים מייצרי. סרגל קנה המידה 3 מיקרומטר.

איור 7. ויזואליזציה של subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדגם biofilm של B. subtilis כ _{'טאפה-CFP, P-srfAA} yfp זן פעמיים שכותרתו נקבע ובחן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זמן חשיפה של 250 מילי שני subpopulations עדות של תאים הפולטים הקרינה גבוהה יותר משאר התאים. אחת subpopulation הביע YFP והוא זוהה רק באמצעות ערוץ YFP (False בצבע בצהוב). זהו subpopulation של יצרנים surfactin. Subpopulation אחר הביע CFP והוא זוהה רק באמצעות chann CFP אל. זהו subpopulation של מפיקי מטריקס. סרגל קנה המידה 3 מיקרומטר.

איור 8. כימות subpopulation של מפיקי מטריקס באמצעות 2-D cytometry הזרימה. מפוזרים תאים biofilm ב ' subtilis P _טאפה-yfp נוטרו באמצעות cytometry הזרימה. Cytometer זרימת ספר 50.000 אירועים האות הקרינה על כל אירוע היה פיקוח. מספר התאים שנמנו הוא להתוות ציר Y בעוד עוצמת האות YFP הוא להתוות ציר ה-X. התאים גדלו במצע LB לקבל ללא תנאים biofilm וישכנע. התאים גדלו MSgg בינוני להשיג biofilm וישכנע תנאים. Subpopulation של מפיקי מטריקס מבדיל רק biofilm וישכנע תנאים. נתון זה הותאם מ לופז et al., PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
איור 9. כימות subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin באמצעות 3-D cytometry הזרימה. אותות הקרינה של הערוצים פיקוח מוצגים ציר ה-X (עבור YFP) וציר Y (עבור CFP). Z-ציר מודד את מספר התאים המבטאים כל עיתונאי והוא לכמת כמו isolines גובה אנכי על המטוס של העיתון. מספר אירועים פיקוח בניסוי זה היה 50.000 אירועים. הפאנל העליון השמאלי מציג את השליטה על הקרינה רקע מחסה אין גנים חלבון פלואורסצנטי. לוח הימנית העליונה מזהה subpopulation של יצרנים surfactin ב הקרינה YFP ערוץ (ממוסגר בצהוב) באמצעות אחת שכותרתו זן P _srfAA-YFP. הפאנל התחתון השמאלי מזהה את subpopulation של מפיקי מטריקס ב הקרינה CFP ערוץ (ממוסגר בכחול) באמצעות מתח יחיד הנקרא P _{טאפה-CFP.} פעמיים שכותרתו זן _טאפה P </ Em>, CFP, _P-srfAA YFP מנוטר בלוח הימנית התחתונה. הוא הראה שני subpopulations כי הם ממוסגרים בצהוב וכחול. נתון זה הותאם מ לופז et al., גנים ופיתוח (2009) 23 :1631-1638.

איור 10. כימות subpopulation של מפיקי מטריקס ו אוכלי אדם באמצעות 3-D cytometry הזרימה. אותות הקרינה של הערוצים פיקוח מוצגים ציר ה-X (עבור YFP) וציר Y (עבור CFP). מספר אירועים פיקוח בניסוי זה היה 50.000. לוח הימנית העליונה מזהה subpopulation של קניבלים ב הקרינה YFP ערוץ (ממוסגר בצהוב) ב זן יחיד הנקרא _P-SKF YFP. הפאנל התחתון השמאלי מזהה את subpopulation של מפיקי מטריקס ב הקרינה CFP ערוץ (ממוסגרת כחול) מתח יחיד הנקרא P _{טאפה-CFP.} דouble שכותרתו זן P _{טאפה-CFP, P-SKF} YFP הראה רק 1 subpopulation של תאים באלכסון כדי צירי X ו-Y (ממוסגר בירוק). Subpopulation אלה מאותרים בערוץ YFP ו CFP כי זה מבטא את שני כתבים במקביל. לופז et al., גנים ופיתוח (2009) 23 :1631-1638.

Discussion

העובדה קהילות חיידקי להראות subpopulations של תאים המבטאים קבוצה מסוימת של ראיות גנים המורכבות של קהילות מיקרוביאלי ^33,34. פרוטוקול זה אמור לעזור לקבוע אם הביטוי של הגן בכל עניין מוגבל subpopulation מסוים של תאים מיוחדים בתוך הקהילה של חיידקים. ויזואליזציה של subpopulations אלה מחייב פיתוח של טכניקות חדשות, כי שיטות מסורתיות כדי לפקח על ביטוי גנים או ניתוח microarray דרג את רמות ביטוי הגנים לקהילת החיידקים כולה תנודות של ביטוי גנים בתוך הקהילה חיידקים הם הפסידו בדרך כלל.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימת המשלים באופן אידיאלי עבור ניתוח של סוגי תאים כדי לספק שילוב של איכותית וכמותית שיגדיר של subpopulation של עניין. המגבלות של טכניקות שני לגרום להם צורך להתייחס אל זה את זה הדואר למען הדיוק של המדידות. במקרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, עוצמת האות מתאי ניאון (ולפעמים גודל subpopulation) משתנה בהתאם לזמן החשיפה לשמש כדי לעורר את הדגימות (בדרך כלל בין 50 ל 200 אלפיות השניה). במקרה של cytometry זרימה עם זאת, גודל קטן של תאים חיידקיים מגביל את איתור חלק חיידקים לא יכולים להיות במעקב. בשל מגבלות גודל התא, האות הקרינה הנפלטת הכתב צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר זיהוי של פלואורסצנציה, דווקא בגלל זה, יש לנו בעיות מנוסים זיהוי של תאים המבטאים כתבים עם רמת ביטוי נמוכה. עם זאת, cytometers זרימת החדשים מגיעים כיום עם הגבלה זיהוי רגיש יותר, אשר מאפשר לנו לעקוב אחר אוכלוסיות חיידקים באופן מדויק יותר. בנוסף, הרגישות הגבוהה גבול גילוי יאפשר לנו assay עבור מיון התא, כדי לבודד את התאים subpopulation אנחנו interesטד ב ולבצע ניתוח ביטוי גנים subpopulation המסוים הזה.