Summary
Dieser Beitrag beschreibt ein Protokoll für die Ganzkörper-Hyperthermie bei Mäusen, die Fieber ähnlichen Bedingungen zu stimulieren bis zu 12-24 Stunden kann.
Abstract
Hyperthermie ist ein allgemeiner Begriff verwendet, um den Anstieg der Körperkerntemperatur über normal zu definieren. Es wird oft verwendet, um die erhöhte Körpertemperatur, die während Fieber beobachtet wird beschreiben. Der Einsatz von Hyperthermie als Adjuvans wurde als vielversprechendes Verfahren für Tumorregression im Bereich der Krebsbiologie entstanden. Zu diesem Zweck ist die wichtigste Anforderung, zuverlässige und gleichmäßige Erwärmung Protokolle haben. Wir haben ein Protokoll zur Hyperthermie (Ganzkörper) in Mäusen entwickelt. In diesem Protokoll werden die Tiere um Zyklen der Hyperthermie für 90 min mit einer Pause von 15 min, gefolgt ausgesetzt. Während dieser Zeit Mäusen haben leichten Zugang zu Nahrung und Wasser. Hohe Körpertemperatur Spikes in den Mäusen während der ersten paar Hyperthermie Exposition Zyklen werden durch Immobilisierung des Tieres verhindert. Zusätzlich wird in normaler Kochsalzlösung ersten Zyklen verabreicht werden, um die Wirkungen von Dehydratisierung zu minimieren. Dieses Protokoll kann simuliert Fieber ähnlichen Bedingungen bei Mäusen bis zu 12-24 Stunden. Wir habenverwendet 8-12 Wochen alte BALB / Cj weiblichen Mäusen, um das Protokoll zu demonstrieren.
Protocol
Ein. Tierethik
Vor der Durchführung der langen Dauer Hyperthermie an Mäusen stellen Sie sicher, dass das Verfahren durch Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt wurde. Alle Verfahren in diesem Papier diskutiert und gezeigt im zugehörigen Video wurden von der Institutional Animal Ethics Committee des National Institute of Immunology zugelassen.
2. Understanding Hyperthermie
Ganzkörperhyperthermie (WBH) durch Anordnen der Tiere in Käfigen, die in vorgewärmtem Inkubator gehalten sind bei 39,5 ° C gegeben gelieferte Während der Standardisierung von Protokoll wurde ein Temperatursensor chirurgisch in den Mäusen implantiert und ihre Körpertemperatur wurde in verschiedenen experimentellen Bedingungen überwacht. Es wurde beobachtet, dass beim Platzieren der Tiere im erwärmten Umgebung, deren Temperatur allmählich von 37 ° C auf bis zu 42 ° C über die Dauer von 100 min (Abbildung 1). The resultierende "spike" in der Temperatur ist faszinierend, wie die interne Körpertemperatur erschossen sogar noch höher als der äußere Umgebungstemperatur.
Wenn der Körper 40 ° C überschritten, würde das Tier Anzeichen von Stress und Dehydratisierung wie Benetzungsmittel um die Schnauze. Erhöhen Sie die Körpertemperatur über 40 ° C, wird die Benetzung und irreversible Stress oder sogar zum Tod der Tiere aufgrund der Hitze Stress führen. Deshalb ist es wichtig, um die Temperaturspitzen während des Verlaufs der Hyperthermie zu verhindern.
Dieses Phänomen der Hochtemperatur-Spikes wird mit der physikalischen Hyperaktivität Tier während Hyperthermie Exposition verbunden. Ähnliche Temperaturspitzen wurden von anderen Gruppen zu und beobachtet mit dem physischen Hyperaktivität des Tieres auf, die die Umwelt mit höheren Temperaturen 10 eingeführt verbunden.
In unserem Protokoll werden die Mäuse während der Hyperthermie Exposition immobilisiert. Alsin 2 dargestellt, verhindert Immobilisierung Tier die Temperaturspitzen.
Wir haben 8-12 Wochen alte BALB / Cj Mäusen zur Demonstration dieses Protokoll verwendet. Das Protokoll ist nicht auf einen bestimmten Typ / Stamm der Mäuse beschränkt.
3. Vorbereitung für die Experiment
3,1 Incubator
Dieses Experiment kann in einem normalen CO 2-Inkubator durchgeführt werden, da sie eine gute Temperaturkontrolle aufweisen. Trennen CO 2-Gas-und Wasser entfernen hält Tablett mit dem CO 2-Inkubator. In einigen Modellen von Inkubatoren ist es möglich, Abschalten des CO 2-Controller. Vereinbaren Regalen des Inkubators, so dass ein Mäusen Käfig bequem innerhalb platziert werden konnte. Stellen Sie die Temperatur des Inkubators bei 39,5 ° C.
3,2 Cages
Typischerweise wird die Hyperthermie Experiment 4 Mäusen zu einer Zeit durchgeführt wird. Zwei Käfige sind erforderlich; aufe wird im Inkubator platziert und der andere ist außerhalb bei Raumtemperatur vorgelegt. Einstreu der Käfige wird vermieden, da die Pflaster Bettausstattungen nass mit Zeit, die in ungleichmäßige Temperaturverteilung innerhalb des Käfigs ergibt geworden. Die Außenseite Käfig sollte Futterpellets und Wasserflasche.
3,3 Mice Immobilisierung Rohren
Im Verlauf der ersten vier Zyklen von Hyperthermie Mäuse werden in perforierten Röhren immobilisiert. Diese Immobilisierung Rohre von 50 ml 'Zentrifuge' Röhren durch piercing 3 mm Löchern ganzen Körper und vier solcher Rohre benötigt werden vorgenommen werden. Die 50ml Tube bequem immobilisieren BALB / Cj Mäuse, die älter als 8 Wochen sind. Rohre der geeigneten Größen können für einige ungewöhnlich unterschiedlichen Stamm von Mäusen oder Mäusen, die sehr jung oder älter als 50 Wochen sind erforderlich.
Ort Immobilisierung Rohren und einem Käfig im Inneren des Inkubator bei 39,5 ° C gehalten wird Warten für mindestens 2 Stunden, so dass der Käfig und immobilization Rohren erreicht die Temperatur des Inkubators.
4. Ersten Zyklus der Hyperthermie
Mäuse können Dehydratation während der Belichtung Hyperthermie erleben. Daher sollten Sie vor Beginn des Experiments, verwalten 0,5 ml Kochsalzlösung intraperitoneal jeder Maus. Verwenden Sie eine 26 G Nadel mit 1 ml Spritze.
Schnell nehmen Sie den Käfig in den Inkubator gestellt, Ort ein Tier in jeder Immobilisierung Rohre und platzieren Sie den Käfig zurück in den Inkubator. Notieren Sie sich die Zeit. Es ist wesentlich, um den Käfig an der gleichen Stelle in den Inkubator jedes Mal zu halten.
Nach 90 min, nehmen Sie den Käfig aus dem Inkubator. Lassen Sie Tiere aus den Immobilisierung Rohre und legen Sie sie in den Käfig bei normaler Temperatur mit einfachem Zugang zu Nahrung und Wasser. Leeren Immobilisierung Röhrchen wieder in den Inkubator.
Nach 15 min wird die zweite Zyklus von Hyperthermie durch Abgabe 0 gestartet.5 ml Kochsalzlösung intraperitoneal an jeder Maus.
Anschließend werden sie in 50 ml perforierten Rohren Immobilisierung immobilisiert und in den Inkubator.
5. Nachfolgende Hyperthermie Cycles
Für ersten vier Zyklen, ist es wesentlich, an Mäuse während der Belichtung und Hyperthermie in den ersten zwei Zyklen immobilisieren, wird Kochsalzinjektion vor Beginn der Hyperthermie Periode.
Nachdem diese Zyklen von Hyperthermie durch Rest folgte abgeschlossen sind, erhalten Mäusen akklimatisieren und werden nicht während der Hyperthermie Exposition hyperaktiv. Die intraperitoneale Injektion von Kochsalzlösung kann nicht notwendig sein, wenn Mäuse problemlos auf Nahrung und Wasser während der Ruhezeit.
6. Nach all den Zyklen abgeschlossen, ist der letzte Schritt, um die Tiere zu untersuchen
Es sollte keine Tod während der Hyperthermie-Zyklen. Jedes Tier hat sehr sorgfältig in der ersten beobachtet werdenpaar Zyklen. Schnell für jede Benetzung der ganzen Schnauze aussehen. Dieses Symptom ist eine Signatur der Austrocknung. Mäuse mit solchen Symptomen sollten sofort 0,5 ml Kochsalzlösung ip und Ruhe bei Raumtemperatur gegeben werden. Die meisten der immobilisierten Mäuse benötigen keine zusätzliche Pflege und erfolgreich tragen die Belastung die Hyperthermie.
Nach Abschluss der erforderlichen Zyklen, können die Tiere schwach aussehen und dehydriert, aber sie werden schnell innerhalb von wenigen Stunden zu erholen.
Abbildung 1. Variation der Körperkerntemperatur Mäuse, wenn der Käfig in einem Inkubator wurde bei 39,5 ° C platziert Nach 90 min wurde der Käfig aus dem Inkubator entnommen und bei 25 ° C. Rote Kreise weisen auf hohe Temperaturspitzen.
Abbildung 2. Variation des Kernkörpers Temwieder eines immobilisierten Mäuse während der Hyperthermie-Zyklen. Nach Immobilisierung des Tieres wurden hohe Temperaturen Spikes nicht beachten, wenn der Käfig bei 39,5 ° C platziert wurde
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Discussion
So weit zurück wie 5000 v. Chr. behandelt ägyptischen Ärzte Tumoren mit Wärme. Die Griechen erkannten den Wert der Wärme in einigen medizinischen Behandlungen. Die ältesten Texte des Gesetzes des Mose erwähnt heißen Quellen (Genesis 36:24), um therapeutisch erhöhen die Körpertemperatur.
Die früheren Techniken verwendet entweder die Verwendung von pyrogenen mikrobiellen Extrakten für die Induktion von Fieber oder heißem Wasser Bäder für die Induktion von Hyperthermie 1. Allerdings keiner dieser Ansätze könnte leicht überwacht oder kontrolliert werden. In unserem Protokoll Mäuse werden zur Hyperthermie in kontrollierter und reproduzierbarer Weise ausgesetzt.
In diesem Verfahren ist es wichtig, ein Auge auf Mäuse zu halten während der ersten beiden Zyklen der Hyperthermie. Bei ihr Fell nass oder übermäßige Benetzung der ganzen Schnauze beobachtet gefunden wird, sollten sie sofort Ruhe gegeben werden und geben Kochsalzlösung intraperiotoneally zu Dehydratation bei Raumtemperatur zu verhindern.
Zelt "> Nach der Wiederherstellung können diese Tiere zur Hyperthermie wieder freigelegt werden. Es ist interessant zu beobachten, dass nach 3-4 Zyklen von Hyperthermie meisten Mäuse werden nicht hyperaktiv und sie aktiv zu verbrauchen Wasser und Nahrung während der Ruhezeit.Ein paar klinische Protokolle für die Verwendung künstlich induzierten Hyperthermie in der Krebsbehandlung haben in jüngster Zeit 4,9,11 entwickelt worden. Es gibt ein paar Berichte über den Einsatz von Hyperthermie sind in Bezug auf Tumorregression 3,5-8,12. In einer kürzlich erschienenen Arbeit, Jia et al. benutzten Mikrowelle Heizungen zum Belichten Tiere auf kurze Dauer (30 min) Ganzkörperhyperthermie 5 haben. Die lange Dauer (Dauer für ein paar Stunden) Ganzkörper-Hyperthermie ist eine größere Herausforderung Verfahren. Wir haben eine sehr einfache und kostengünstige Protokoll für lange Dauer Hyperthermie Exposition beschrieben. Es ist ein sehr vielversprechendes Werkzeug, eine umfassende Strategie für die Behandlung von Krebs zu entwickeln. Bei größeren Bewusstsein für die Einfachheit und Nützlichkeit of Hyperthermie Verfahren, kann es immer beliebter unter den Forschern und Klinikern 2.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
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