Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול ליפרתרמיה כל גוף בעכברים שיכולים לעורר חום כמו תנאים עד 12-24 שעות.
Abstract
היפרתרמיה היא מונח כללי המשמש להגדרת העלייה בחום גוף גבוה מרגיל. הוא משמש לעתים קרובות כדי לתאר את חום הגוף המוגבר שנצפה בחום. השימוש בהיפרתרמיה כאדג'ובנט התפתח הליך מבטיח לנסיגה של גידול בתחום הביולוגיה של הסרטן. לצורך כך, הדרישה החשובה ביותר היא שתהיה לי פרוטוקולי חימום אמינים ואחידים. פתחנו פרוטוקול ליפרתרמיה (כל גוף) בעכברים. בפרוטוקול זה, בעלי חיים נחשפים למחזורים של היפרתרמיה ל90 דקות ואחרי תקופת מנוחה של 15 דקות. במהלך תקופה זו עכברים יש גישה קלה למזון ומים. קוצי טמפרטורת גוף גבוהים בעכברים במהלך כמה מחזורי חשיפת היפרתרמיה הראשונים מנעו ידי עצירת בעלי החיים. בנוסף, מי מלח רגיל הוא מנוהל בכמה מחזורים הראשונים כדי למזער את ההשפעות של התייבשות. פרוטוקול זה יכול לדמות חום כמו תנאים בעכברים עד 12-24 שעות. יש לנושימוש 8-12 שבועות עכברים זקנים BALB / Cj נשיים להפגין את הפרוטוקול.
Protocol
1. אתיקה של בעלי חיים
לפני ביצוע היפרתרמיה משך זמן הארוכה על עכברים לוודא שההליך אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה ושימוש. כל ההליכים שנדונו במאמר זה ושמוצגים בוידאו הנלווה, אושרו על ידי ועדת אתיקת בעלי החיים המוסדית של המכון הלאומי לאימונולוגיה.
2. היפרתרמיה הבנה
היפרתרמיה כל גוף (WBH) מועברת על ידי נחת את החיות בכלובי prewarmed אשר ממוקמים בחממה נשמרה ב39.5 ° C. במהלך סטנדרטיזציה של פרוטוקול, חיישן טמפרטורה שמושתל בעכברים וטמפרטורת הגוף שלהם הייתה פיקוח בתנאי ניסוי שונים. היה נראה כי בעת ביצוע את החיות בסביבה מחוממת, הטמפרטורה שלהם עלו בהדרגה מ 37 מעלות צלזיוס לעד 42 ° C מעל משך 100 דקות (איור 1). הדואר כתוצאה "ספייק" בטמפרטורה הוא מסקרן כמו טמפרטורת הגוף הפנימית נורתה אף גבוהה יותר מטמפרטורת הסביבה החיצונית.
כאשר טמפרטורת הגוף עולה על 40 מעלות צלזיוס, החיה היית להראות סימנים של לחץ והתייבשות כגון הרטבה סביב החוטם. הגדל את טמפרטורת הגוף מעבר ל40 ° C, יוביל להרטבה ומתח בלתי הפיך ואף למוות של בעלי חיים עקב עומס חום. לכן חשוב למנוע את קוצי הטמפרטורה במהלך הקורס של היפרתרמיה.
תופעה זו של קוצים בטמפרטורה גבוה קשורה ליפראקטיביות הפיסית של חיה במהלך חשיפת היפרתרמיה. קוצי טמפרטורה דומים נצפו גם על ידי קבוצות אחרות והיו קשורים עם היפראקטיביות הפיסית של החיה על שהוצג לסביבה שטמפרטורות גבוהות יותר 10.
בפרוטוקול שלנו, עכברים משותקים במהלך חשיפת היפרתרמיה. כמושמוצג באיור 2, קיבוע של חיה מונע את הקוצים בטמפרטורה.
יש לנו להשתמש 8-12 שבועות עכברים זקנים BALB / Cj להוכחה בפרוטוקול זה. הפרוטוקול אינו מוגבל לסוג מסוים / זן של העכברים.
3. מתכונן לניסוי
3.1 חממה
ניסוי זה יכול להתבצע בCO 2 חממה רגילה כמו שיש להם שליטה בטמפרטורה טובה. ניתק אספקת גז CO 2 ולהסיר מגש מחזיק מים של CO 2 החממה. בחלק מהדגמים של חממות ניתן לכבות את בקר CO 2. סידור מדפים בחממה, כך שכלוב עכברים יכול להיות ממוקם במקום נוח בפנים. הגדר את הטמפרטורה בחממה ב39.5 מעלות צלזיוס
3.2 כלובים
בדרך כלל, הניסוי מתבצע היפרתרמיה על 4 עכברים בכל פעם. שני כלובים נדרשים; עלהדואר ממוקם בתוך החממה והשנייה ממוקם מחוץ בטמפרטורת חדר. מצעים של כלובים הוא נמנע, כמו הכתמים של מצעים רטובים הפכו עם זמן וכתוצאה מכך הטמפרטורה לא אחידה בתוך הכלוב. הכלוב צריך להיות מחוץ כופתות מזון ובקבוקי מים.
3.3 עכברי צינורות Immobilization
במהלך 4 המחזורים הראשונים של עכברי היפרתרמיה הם משותק בצינורות מחוררים. צינורות Immobilization אלה יכולים להיות עשויים מהצינורות 50 'צנטריפוגות' המ"ל על ידי 3 מ"מ חורי פירסינג בכל רחבי יידרשו גופו וארבעה מצינורות כאלה. 50 מיליליטר השפופרת נוחה יכולה לשתק עכברי BALB / Cj שישנים יותר מ 8 שבועות. צינורות בגדלים מתאימים עשויים להידרש לקצת מתח שונה מרגיל של עכברים או לעכברים שהם מאוד צעירים או מבוגרים יותר מ -50 שבועות.
צינורות קיבוע מקום וכלוב בתוך החממה נשמרו ב39.5 ° C. חכה לפחות 2 שעות, כך שכלוב ואניצינורות mmobilization להשיג את הטמפרטורה בחממה.
4. המחזור ראשון של היפרתרמיה
עכברים עלולים לחוות התייבשות במהלך חשיפת היפרתרמיה. לכן לפני תחילת הניסוי, לנהל intraperitoneally המלוח נורמלי מ"ל 0.5 לכל עכבר. השתמש במחט 26 G עם מזרק 1 מ"ל.
מהר להוציא את הכלוב הונח בחממה, מקום בעל חיים אחד בכל צינורות וקיבוע הנח חזרה כלוב בחממה. רשום את הזמן. זה חיוני כדי לשמור על הכלוב באותו המקום בחממה בכל פעם.
לאחר 90 דקות, מוציא את הכלוב מהחממה. לשחרר בעלי חיים מצינורות Immobilization ולמקם אותם בכלוב בטמפרטורה נורמלית עם גישה נוחה למזון ומים. הנח צינורות Immobilization ריקים בחזרה בחממה.
לאחר 15 דקות, המחזור השני של היפרתרמיה מופעל על ידי אספקת 0.intraperitoneally 5 מ"ל מי מלח לכל עכבר.
אז הם משותקים ב50 צינורות מחוררים Immobilization מ"ל והושמו באינקובטור.
5. מחזורי היפרתרמיה הבאים
במשך 4 מחזורים הראשונים, זה חיוני כדי לשתק עכברים במהלך חשיפת היפרתרמיה ולשני המחזורים הראשונים, הזרקה מי מלח ניתן לפני תחילת תקופת היפרתרמיה.
לאחר המחזורים אלה של היפרתרמיה ואחריו שאר סקרים, עכברים לקבל להתאקלם ואינם הופכים להיפראקטיביים במהלך חשיפת היפרתרמיה. ההזרקה של מי מלח intraperitoneal לא יכולה להיות הכרחית אם עכברים בקלות לקחת את מזון ומים בזמן המנוחה.
6. לאחר כל המחזורים הושלמו, השלב הסופי הוא לבחון את בעלי החיים
לא צריך להיות כל מוות במהלך מחזורי היפרתרמיה. לכל בעל חיים יש להיות התבוננו בקפידה ב1כמה מחזורים. מהירות לחפש כל הרטבה סביב החוטם. תופעה זו היא חתימתו של התייבשות. עכברים עם סימפטומים אלה באופן מיידי יש לתת ip 0.5 מ"ל סליין נורמלי ומנוחה בטמפרטורת חדר. רוב העכברים המשותקים לא דורשים כל טיפול נוסף וישא את הלחץ בהצלחה היפרתרמיה.
לאחר שסיים את המחזורים נדרשים, בעלי חיים עשויים להיראות חלשים ומיובשים אבל הם יתאוששו במהירות תוך מספר שעות.
איור 1. וריאציה של טמפרטורת גוף הליבה של עכברים כאשר הכלוב הושם באינקובטור ב39.5 ° C. לאחר 90 דקות הכלוב הוסר מהחממה והניח במהירות של 25 ° C. עיגולים אדומים מצביעים על קוצים בטמפרטורה גבוהה.
איור 2. וריאציה של temperatu גוף הליבהמחדש של עכברים חסרי יכולת תנועה במהלך מחזורי היפרתרמיה. לאחר לשתק את החיה, קוצי טמפרטורות גבוהים לא להתבונן בי הכלוב הונח ב39.5 מעלות צלזיוס
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כבר ב 5000 לפנה"ס, רופאים מצריים לטפל גידולים עם חום. היוונים הכירו בערכו של חום בחלק מהטיפולים רפואיים. את הטקסטים העתיקים ביותר של תורת משה אזכור מעיינות חמות (בראשית 36:24) כדי להעלות את טמפרטורת גוף טיפולי.
הטכניקות הקודמות הועסקו או השימוש בתמציות של חיידקי pyrogenic לאינדוקציה של חום או אמבטיות מים חמות לזירוז של היפרתרמיה 1. אולם אף לא אחד מהגישות האלה יכולה להיות מנוטר בקלות או בשליטה. בעכברי פרוטוקולנו נחשפים ליפרתרמיה באופן מבוקר ושחזור.
בהליך זה חשוב לפקוח עין על עכברים בשני המחזורים הראשונים של היפרתרמיה. במקרה פרוותם נמצאה הרטבה רטובה או מוגזמת נצפתה סביב החוטם, הם צריכים להינתן באופן מיידי ולתת מנוחת intraperiotoneally המלוח הרגיל כדי למנוע התייבשות בטמפרטורת חדר.
> "אוהל לאחר התאוששות, בעלי חיים מסוג זה עלול להיות חשופים ליפרתרמיה שוב. זה מעניין לציין, כי לאחר מחזורי 3-4 היפרתרמיה רוב העכברים לא הופכים היפראקטיבי והם פעילים צורכים מים ומזון במהלך תקופת המנוחה.כמה פרוטוקולים קליניים לשימוש בהיפרתרמיה אמצעים מלאכותיים בטיפול בסרטן פותחו בתקופה האחרונה 4,9,11. יש כמה דיווחים על שימוש בהיפרתרמיה הם ביחס לנסיגת גידול 3,5-8,12. במאמר אחרון, ג'יה et al. השתמש תנורי מיקרוגל לחשיפת בעלי חיים ליפרתרמיה כל הגוף 5 משך זמן קצר (30 דקות). משך הזמן הארוך (שנמשך כמה שעות) היפרתרמיה כל גוף הוא הליך יותר מאתגר. כבר תארנו פרוטוקול פשוט מאוד וזול לחשיפת היפרתרמיה משך זמן ארוכה. זהו כלים מאוד מבטיחים לפתח אסטרטגיה מקיפה לטיפול בסרטן. עם מודעות גדולות יותר בפשטות והשירות oהליך היפרתרמיה f, זה יכול להיות יותר פופולרי בקרב חוקרים וקלינאים 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
- Braude, A. I., Beck, J., Zalesky, M. Febrile response to bacterial pyrogens in leukemia. Blood. 16, 1279 (1960).
- Dovern, E. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy added to the treatment of ovarian cancer. A review of achieved results and complications. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 31, 256 (2010).
- Gaworek, J., Mayer, C. T. Systemic whole body hyperthermia in oncology: fatal heat for tumor cells. Pflege. Z. 56, 15 (2003).
- Hegewisch-Becker, S. Effects of whole body hyperthermia (41.8 degrees C) on the frequency of tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced malignancies. Clin. Cancer Res. 9, 2079 ( ).
- Jia, D. Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 27, 275 (2011).
- Maluta, S., Dall'oglio, S., Nadalini, L. Treatment for intermediate and high-risk prostate cancer: controversial issues and the role of hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 765 (2010).
- Moyer, H. R., Delman, K. A. The role of hyperthermia in optimizing tumor response to regional therapy. Int. J. Hyperthermia. 24, 251 (2008).
- Muthana, M., Multhoff, G., Pockley, A. G. Tumour infiltrating host cells and their significance for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 247 (2010).
- Ostberg, J. R., Repasky, E. A. Comparison of the effects of two different whole body hyperthermia protocols on the distribution of murine leukocyte populations. Int. J. Hyperthermia. 16, 29 (2000).
- Pritchard, M. T. Protocols for simulating the thermal component of fever: preclinical and clinical experience. Methods. 32, 54 (2004).
- Repasky, E. A. Characterization of mild whole-body hyperthermia protocols using human breast, ovarian, and colon tumors grown in severe combined immunodeficient mice. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7, 19 (1999).
- Willnow, U. Treatment of otherwise incurable tumor diseases in childhood using whole-body hyperthermia and chemotherapy. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 208 (1989).
