Summary
Il presente documento descrive un protocollo per ipertermia tutto il corpo nei topi che possono stimolare la febbre come condizioni fino a 12-24 ore.
Abstract
Ipertermia è un termine generico usato per definire l'aumento della temperatura corporea superiore al normale. E 'spesso usato per descrivere l'aumento della temperatura corporea che si osserva durante la febbre. L'uso di ipertermia come adiuvante è emerso come una procedura promettente per regressione del tumore nel campo della biologia del cancro. A questo scopo, il requisito più importante è avere protocolli riscaldamento affidabile e uniforme. Abbiamo sviluppato un protocollo per ipertermia (corpo) nei topi. In questo protocollo, gli animali sono esposti a cicli di ipertermia per 90 min seguito da un periodo di riposo di 15 min. Durante questo periodo i topi hanno facile accesso a cibo e acqua. Alti picchi di temperatura del corpo nei topi durante i cicli di ipertermia primi esposizione viene impedito immobilizzando l'animale. Inoltre, soluzione salina viene somministrata prima pochi cicli per minimizzare gli effetti della disidratazione. Questo protocollo in grado di simulare condizioni di febbre come nei topi fino a 12-24 ore. Abbiamoutilizzato 8-12 settimane vecchi BALB / Cj topi femmina per dimostrare il protocollo.
Protocol
1. Animal Ethics
Prima di eseguire l'ipertermia lunga durata sui topi fare in modo che la procedura sia stata approvata dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. Tutte le procedure descritte in questo documento e mostrato nel video allegato è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale Animale dell'Istituto Nazionale di Immunologia.
2. Comprendere Ipertermia
L'ipertermia Whole Body (WBH) viene fornito mettendo gli animali in gabbia preriscaldata che vengono inseriti nella incubatore mantenuto a 39,5 ° C. Durante la standardizzazione del protocollo, un sensore di temperatura è stato impiantato chirurgicamente nei topi e la loro temperatura corporea è stata monitorata in diverse condizioni sperimentali. È stato osservato che contestualmente all'invio degli animali in ambiente riscaldato, la temperatura gradualmente aumentata da 37 ° C fino a 42 ° C per la durata di 100 min (Figura 1). The conseguente "spike" in temperatura è interessante in quanto la temperatura corporea interna girato addirittura superiore alla temperatura dell'ambiente esterno.
Quando la temperatura corporea supera i 40 ° C, l'animale mostra segni di stress e disidratazione come bagnare intorno al muso. Aumentare la temperatura corporea di 40 ° C, porterà alla bagnatura e stress irreversibili o addirittura la morte degli animali a causa di stress da calore. Quindi è importante prevenire i picchi di temperatura durante il corso di ipertermia.
Questo fenomeno di picchi di alta temperatura è associato con l'iperattività fisica di animali durante l'esposizione ipertermia. Picchi di temperatura simili sono stati osservati anche da altri gruppi e sono stati associati con l'iperattività fisica dell'animale dopo essere stato introdotto ambiente con temperature superiori 10.
Nel nostro protocollo, i topi sono immobilizzati durante l'esposizione ipertermia. Comeillustrato nella figura 2, immobilizzazione animale evita i picchi di temperatura.
Abbiamo usato 8-12 settimane vecchi BALB / Cj topi per dimostrare questo protocollo. Il protocollo non è limitata ad un particolare tipo / ceppo dei topi.
3. Preparazione per l'esperimento
3,1 Incubatore
Questo esperimento può essere eseguita in un normale CO 2 incubatore in quanto hanno un buon controllo della temperatura. Scollegare CO 2 gas e rimuovere il vassoio di ritenzione idrica del CO 2 incubatore. In alcuni modelli di incubatori è possibile spegnere il CO 2 controller. Disporre ripiani dell'incubatore in modo che una gabbia topi potrebbe essere convenientemente posizionati all'interno. Impostare la temperatura del termostato a 39,5 ° C.
3,2 Gabbie
Tipicamente, l'esperimento ipertermia viene eseguita su topi 4 alla volta. Due gabbie sono necessarie; sule viene collocato all'interno dell'incubatrice e l'altro è posto fuori a temperatura ambiente. Biancheria di gabbie è evitato, come le macchie di biancheria si bagnano con il tempo che si traduce in non uniforme della temperatura all'interno della gabbia. La gabbia esterna dovrebbe avere pellet alimentari e bottiglia d'acqua.
3,3 Mouse immobilizzazione tubi
Nel corso del primi 4 cicli di ipertermia topi sono immobilizzati in tubi forati. Questi tubi di immobilizzazione può essere fatto da 50 provette 'centrifuga' ml di perforazione 3 mm fori su tutto il corpo e quattro di tali tubi sarà richiesto. Il tubo 50ml può comodamente immobilizzare BALB / Cj topi di età superiore a 8 settimane. Tubi di dimensioni adeguate può essere richiesto per un po 'di sforzo insolitamente diversi di topi o per i topi che sono molto giovani o di età superiore a 50 settimane.
Tubi immobilizzazione posto e una gabbia all'interno della incubatore mantenuto a 39,5 ° C. Attendere almeno due ore in modo che la gabbia e hotubi mmobilization raggiungere la temperatura dell'incubatore.
4. Primo ciclo di ipertermia
I topi possono andare incontro a disidratazione durante l'esposizione ipertermia. Quindi prima di iniziare l'esperimento, amministrare 0,5 ml soluzione fisiologica per via intraperitoneale ad ogni mouse. Utilizzare un ago 26 G con siringa da 1 ml.
Rapidamente smontare la gabbia posta in incubatrice, posto un animale in ogni tubi immobilizzazione e posizionare la gabbia in incubatrice. Registrare il tempo. E 'essenziale per mantenere la gabbia nello stesso luogo in incubatrice ogni volta.
Dopo 90 minuti, togliere la gabbia dal termostato. Rilasciare gli animali dai tubi di immobilizzazione e metterli in gabbia a temperatura normale, con facile accesso al cibo e all'acqua. Inserire le provette immobilizzazione vuoti di nuovo in incubatrice.
Dopo 15 min, il secondo ciclo di ipertermia viene avviato fornendo 0.5 ml di soluzione fisiologica per via intraperitoneale ad ogni topo.
Essi vengono poi immobilizzate in provette da 50 ml immobilizzazione forati e posto nell'incubatrice.
5. Cicli Ipertermia successivi
Per primi 4 cicli, è essenziale immobilizzare topi durante l'esposizione ipertermia e per i primi due cicli, iniezione di soluzione salina è data prima dell'inizio del periodo di ipertermia.
Dopo questi cicli di ipertermia seguiti da altri sono stati completati, i topi ottenere acclimatarsi e non diventare iperattivi durante l'esposizione ipertermia. L'iniezione intraperitoneale di soluzione salina può non essere necessario se i topi facilmente portare cibo e acqua durante il tempo di riposo.
6. Dopo aver completato tutti i cicli, il passo finale è quello di esaminare gli Animali
Non ci dovrebbe essere alcuna morte durante i cicli di ipertermia. Ogni animale deve essere attentamente osservato il primopochi cicli. Rapidamente cercare qualsiasi bagnante intorno al muso. Questo sintomo è una firma di disidratazione. I topi con questi sintomi deve essere immediatamente data ip 0,5 ml soluzione fisiologica e di riposo a temperatura ambiente. La maggior parte dei topi immobilizzati non richiedono alcuna cura supplementare, e con successo sopportare lo stress della ipertermia.
Dopo aver completato i cicli richiesti, gli animali possono apparire debole e disidratato, ma saranno presto recuperare entro poche ore.
Figura 1. Variazione della temperatura corporea dei topi quando la gabbia è stata posta in un incubatore a 39,5 ° C. Dopo 90 min la gabbia è stato rimosso dal termostato e posto a 25 ° C. Cerchi rossi indicano picchi di alta temperatura.
Figura 2. Variazione della tempe corpo di mandrinore di un topi immobilizzati durante i cicli di ipertermia. Dopo immobilizzare l'animale, alte temperature picchi non osservare quando la gabbia è stata posta a 39,5 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Già nel 5000 aC, i medici egiziani tumori trattati con il calore. I Greci riconosciuto il valore di calore in alcuni trattamenti medici. I testi più antichi della Legge di Mosè menzione sorgenti termali (Genesi 36:24), per elevare la temperatura corporea terapeuticamente.
Le tecniche precedenti impiegato sia l'uso di estratti microbici pirogene per l'induzione della febbre o bagni di acqua calda per l'induzione di ipertermia 1. Tuttavia nessuno di questi approcci potrebbe essere facilmente controllata o controllata. Nei nostri topi protocollo sono esposti a ipertermia in modo controllato e riproducibile.
In questa procedura, è importante mantenere un orologio sul topi durante i primi due cicli di ipertermia. Nel caso in cui la loro pelliccia si trova bagnare bagnato o eccessivo osservato intorno al muso, devono essere immediatamente dato riposo e dare soluzione salina normale intraperiotoneally per prevenire la disidratazione a temperatura ambiente.
tenda "> Dopo il recupero, tali animali possono essere esposti a ipertermia di nuovo. E 'interessante osservare che, dopo 3-4 cicli di ipertermia maggior parte dei mouse non diventano iperattivi e hanno attivamente consumano acqua e cibo durante il periodo di riposo.A pochi protocolli clinici per uso ipertermia indotta artificialmente nel trattamento del cancro sono stati sviluppati negli ultimi tempi 4,9,11. Ci sono alcuni rapporti sull'uso di ipertermia sono in relazione alla regressione del tumore 3,5-8,12. In un recente articolo, Jia et al. hanno utilizzato riscaldatori a microonde per esporre gli animali a breve durata (30 min) ipertermia corpo 5. La lunga durata (della durata di un paio d'ore) ipertermia tutto il corpo è una procedura più impegnativo. Abbiamo descritto un protocollo molto semplice e poco costoso per esposizione lunga durata ipertermia. Si tratta di uno strumento molto promettente per sviluppare una strategia globale per il trattamento del cancro. Con una maggiore consapevolezza sulla o semplicità e utilitàipertermia procedura f, può diventare più popolare tra i ricercatori e clinici 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
- Braude, A. I., Beck, J., Zalesky, M. Febrile response to bacterial pyrogens in leukemia. Blood. 16, 1279 (1960).
- Dovern, E. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy added to the treatment of ovarian cancer. A review of achieved results and complications. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 31, 256 (2010).
- Gaworek, J., Mayer, C. T. Systemic whole body hyperthermia in oncology: fatal heat for tumor cells. Pflege. Z. 56, 15 (2003).
- Hegewisch-Becker, S. Effects of whole body hyperthermia (41.8 degrees C) on the frequency of tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced malignancies. Clin. Cancer Res. 9, 2079 ( ).
- Jia, D. Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 27, 275 (2011).
- Maluta, S., Dall'oglio, S., Nadalini, L. Treatment for intermediate and high-risk prostate cancer: controversial issues and the role of hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 765 (2010).
- Moyer, H. R., Delman, K. A. The role of hyperthermia in optimizing tumor response to regional therapy. Int. J. Hyperthermia. 24, 251 (2008).
- Muthana, M., Multhoff, G., Pockley, A. G. Tumour infiltrating host cells and their significance for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 247 (2010).
- Ostberg, J. R., Repasky, E. A. Comparison of the effects of two different whole body hyperthermia protocols on the distribution of murine leukocyte populations. Int. J. Hyperthermia. 16, 29 (2000).
- Pritchard, M. T. Protocols for simulating the thermal component of fever: preclinical and clinical experience. Methods. 32, 54 (2004).
- Repasky, E. A. Characterization of mild whole-body hyperthermia protocols using human breast, ovarian, and colon tumors grown in severe combined immunodeficient mice. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7, 19 (1999).
- Willnow, U. Treatment of otherwise incurable tumor diseases in childhood using whole-body hyperthermia and chemotherapy. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 208 (1989).
