Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor het hele lichaam hyperthermie bij muizen die koorts kunnen als voorwaarden te stimuleren tot 12 tot 24 uur.
Abstract
Hyperthermie is een algemene term die wordt gebruikt om de stijging van de kerntemperatuur van het lichaam boven de normale definiëren. Het wordt vaak gebruikt om de verhoogde lichaamstemperatuur die wordt waargenomen tijdens koorts beschreven. Gebruik van hyperthermie als adjuvans is ontstaan als een veelbelovende procedure voor tumor regressie op het gebied van kankerbiologie. Hiertoe is de belangrijkste eis aan betrouwbare en gelijkmatige verwarming protocollen. We hebben een protocol ontwikkeld voor hyperthermie (gehele lichaam) in muizen. In dit protocol worden de dieren blootgesteld aan cycli van hyperthermie gedurende 90 min gevolgd door een rusttijd van 15 minuten. Tijdens deze periode muizen gemakkelijk toegang hebben tot voedsel en water. Hoge lichaamstemperatuur spikes in de muizen tijdens de eerste paar cycli hyperthermie blootstelling worden voorkomen door het immobiliseren van het dier. Bovendien wordt normale zoutoplossing toegediend in eerste cycli om de effecten van dehydratie minimaliseren. Dit protocol kan simuleren koorts achtige omstandigheden bij muizen tot 12 tot 24 uur. We hebbengebruikt 8-12 weken oude Balb / Cj vrouwelijke muizen om het protocol aan te tonen.
Protocol
1. Animal Ethics
Voor het uitvoeren van de lange duur hyperthermie op muizen ervoor te zorgen dat de procedure is goedgekeurd door Institutional Animal Care en gebruik Comite. Alle procedures die in dit document en in de bijbehorende video werd goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee van het National Institute of Immunology.
2. Inzicht Hyperthermie
Whole Body Hyperthermie (WBH) wordt geleverd door het plaatsen van de dieren in voorverwarmde kooien die in incubator geplaatst gehandhaafd op 39,5 ° C. Tijdens de standaardisatie van protocol werd een temperatuursensor chirurgisch geïmplanteerd in muizen en hun lichaamstemperatuur werd gevolgd in verschillende experimentele condities. Er werd waargenomen dat bij het plaatsen van de dieren verwarmde omgeving, geleidelijk de temperatuur steeg van 37 ° C tot maximaal 42 ° C voor de duur van 100 min (figuur 1). The resulterende "spike" in de temperatuur is intrigerend als de interne lichaamstemperatuur schoot zelfs hoger dan de externe milieu-temperatuur.
Wanneer het lichaam 40 ° C overschreden, zou het dier tekenen van stress en uitdroging zoals bevochtigingsmiddelen rond de snuit. Verhoog de lichaamstemperatuur boven 40 ° C, zal leiden tot bevochtiging en onomkeerbare stress of zelfs de dood van dieren door hittestress. Dus is het belangrijk te voorkomen dat de temperatuur spikes in de loop van hyperthermie.
Dit fenomeen van hoge temperatuur spikes wordt geassocieerd met hyperactiviteit van de fysieke dier tijdens hyperthermie blootstelling. Vergelijkbare temperatuur spikes werden waargenomen door andere groepen ook en werden in verband gebracht met de fysieke hyperactiviteit van het dier na te zijn voorgesteld aan omgeving met hogere temperaturen 10.
In ons protocol worden muizen geïmmobiliseerd tijdens de hyperthermie belichting. Alsgetoond in figuur 2, immobilisatie van dieren voorkomt dat de temperatuur spikes.
We hebben gebruik gemaakt 8-12 weken oude Balb / Cj muizen voor het aantonen van dit protocol. Het protocol is niet beperkt tot een bepaald type / stam van de muizen.
3. Voorbereiding op het Experiment
3,1 Incubator
Dit experiment kan worden uitgevoerd in een normale CO 2 incubator omdat ze een goede temperatuurregeling. Ontkoppel CO 2 gas los en verwijder het water houden lade van de CO 2 incubator. In sommige modellen van incubators is het mogelijk om het uitschakelen van de CO 2-controller. Schik schappen van de incubator, zodat een muizen kooi kan gemakkelijk binnen worden geplaatst. Stel de temperatuur van de incubator bij 39,5 ° C.
3,2 Kooien
Typisch wordt de hyperthermie experiment uitgevoerd op 4 muizen per keer. Twee kooien nodig, aane wordt geplaatst in de incubator en de ander buiten geplaatst bij kamertemperatuur. Beddengoed kooien vermeden, als de vlakjes van beddengoed nat met de tijd waardoor ongelijkmatige temperatuur in de kooi. De buitenkant kooi moet voedsel pellets en waterfles.
3,3 Muizen immobilisatie buizen
Tijdens eerste 4 cycli van hyperthermie muizen geïmmobiliseerd in geperforeerde buizen. Deze immobilisatie buizen worden gemaakt van 50 ml "centrifuge" buizen door piercing 3 mm gaten over zijn hele lichaam en vier van dergelijke buizen is vereist. De 50 ml buis kan gemakkelijk immobiliseren BALB / Cj muizen die ouder zijn dan 8 weken. Buizen van geschikte afmetingen nodig zijn voor sommige ongebruikelijk andere stam van muizen of muizen die zeer jong of ouder dan 50 weken.
Place immobilisatie buizen en een kooi in de incubator gehouden bij 39,5 ° C. Wacht ten minste 2 uur, zodat de kooi immobilization buizen bereikt de temperatuur van de incubator.
4. Eerste cyclus van de hyperthermie
Muizen kunnen ervaren uitdroging tijdens de hyperthermie belichting. Daarom voor het begin van het experiment, beheren 0,5 ml normale fysiologische zoutoplossing intraperitoneaal aan elke muis. Gebruik een 26 G naald met 1 ml spuit.
Snel af met de kooi geplaatst in de incubator, plaats een dier in elk immobilisatie buizen en plaats de kooi terug in de incubator. Noteer de tijd. Het is essentieel om de kooi te houden op dezelfde plaats in de incubator elke keer.
Na 90 min, neem de kooi uit de incubator. Laat dieren uit de immobilisatie buizen en plaats ze in de kooi bij normale temperatuur met gemakkelijke toegang tot voedsel en water. Terug te plaatsen lege immobilisatie buizen in de incubator.
Na 15 min wordt de tweede cyclus van hyperthermie gestart door het leveren 0.5 ml zoutoplossing intraperitoneaal toegediend aan elke muis.
Ze worden vervolgens geïmmobiliseerd in 50 ml geperforeerde buizen immobilisatie en in de incubator.
5. Latere Hyperthermie Cycles
Voor de eerste 4 cycli, is het essentieel om te immobiliseren muizen tijdens de hyperthermie blootstellingsroute en voor de eerste twee cycli, wordt zoutoplossing gegeven voor het begin van de hyperthermie periode.
Na deze cycli van hyperthermie gevolgd door rust zijn voltooid, muizen krijgen acclimatiseren en niet hyperactief worden tijdens de hyperthermie belichting. De intraperitoneale injectie van zoutoplossing niet nodig als muizen gemakkelijk voedsel en water tijdens de rusttijd.
6. Na alle cycli voltooid, de laatste stap is het onderzoeken van de Dieren
Er enige dood niet tijdens de hyperthermie cycli. Elk dier moet zeer zorgvuldig worden bekeken in het eerstecycli. Snel zoeken naar eventuele bevochtiging rond de snuit. Dit symptoom is een handtekening van uitdroging. Muizen met dergelijke symptomen te worden gegeven onmiddellijk 0,5 ml normale zoutoplossing ip en rust bij kamertemperatuur. Het grootste deel van de geïmmobiliseerde muizen vergt geen specifieke extra zorg en met succes dragen de stress van de hyperthermie.
Na het voltooien van benodigde cycli, kunnen dieren kijken zwak en uitgedroogd, maar ze zullen snel herstellen binnen enkele uren.
Figuur 1. Variatie van de kerntemperatuur van muizen wanneer de kooi werd in een incubator bij 39,5 ° C. Na 90 min werd de kooi uit de incubator en geplaatst bij 25 ° C. Rode cirkels geven aan hoge temperatuur spikes.
Figuur 2. Variatie van de kerntemperatuur van het lichaam temperatuopnieuw van een geïmmobiliseerd muizen tijdens de hyperthermie cycli. Na het immobiliseren van het dier werden hoge temperaturen spikes niet aan wanneer de kooi werd geplaatst bij 39,5 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Al in 5000 voor Christus, Egyptische artsen behandelde tumoren met warmte. De Grieken ontdekten de waarde van de warmte in sommige medische behandelingen. De oudste teksten van de wet van Mozes vermelding hete bronnen (Genesis 36:24) om therapeutisch te verheffen lichaamstemperatuur.
De eerdere technieken ofwel het gebruik van pyrogeen microbiële extracten voor inductie van koorts of warm water baden voor de inductie van hyperthermie 1. Geen van deze benaderingen gemakkelijk toezicht kan worden gehouden. In ons protocol muizen worden blootgesteld aan hyperthermie in een gecontroleerde en reproduceerbare wijze.
In deze procedure is het belangrijk om een gaten houden muizen tijdens de eerste twee cycli van hyperthermie. In het geval dat hun vacht wordt gevonden nat of overmatige bevochtiging waargenomen rond de snuit, moeten ze onmiddellijk worden rust gegeven en geven een fysiologische zoutoplossing intraperiotoneally om uitdroging te voorkomen bij kamertemperatuur.
tent "> Na herstel, kan een dergelijke dieren worden blootgesteld aan hyperthermie weer. Het is interessant op te merken dat na 3-4 cycli van hyperthermie de meeste muizen niet hyperactief worden en zij actief water en voedsel te consumeren tijdens de rustperiode.Een paar klinische protocollen voor het gebruik van kunstmatig geïnduceerde hyperthermie bij de behandeling van kanker zijn ontwikkeld in de afgelopen tijd 4,9,11. Er zijn enkele rapporten over gebruik van hyperthermie zijn ten opzichte van tumorregressie 3,5-8,12. In een recent artikel, Jia et al.. gebruikt microgolf verwarmingstoestellen voor het blootstellen dieren gedurende korte duur (30 min) hele lichaam hyperthermie 5. De lange duur (voor de duur van een paar uur) total body-hyperthermie is een meer uitdagende procedure. Wij hebben er een zeer eenvoudige en goedkope protocol voor langdurige blootstelling hyperthermie. Het is een zeer veelbelovend instrument om een alomvattende strategie voor de behandeling van kanker te ontwikkelen. Met een groter bewustzijn op de eenvoud en het nut of hyperthermie ingreep, kan het steeds populairder geworden bij onderzoekers en clinici 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
- Braude, A. I., Beck, J., Zalesky, M. Febrile response to bacterial pyrogens in leukemia. Blood. 16, 1279 (1960).
- Dovern, E. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy added to the treatment of ovarian cancer. A review of achieved results and complications. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 31, 256 (2010).
- Gaworek, J., Mayer, C. T. Systemic whole body hyperthermia in oncology: fatal heat for tumor cells. Pflege. Z. 56, 15 (2003).
- Hegewisch-Becker, S. Effects of whole body hyperthermia (41.8 degrees C) on the frequency of tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced malignancies. Clin. Cancer Res. 9, 2079 ( ).
- Jia, D. Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 27, 275 (2011).
- Maluta, S., Dall'oglio, S., Nadalini, L. Treatment for intermediate and high-risk prostate cancer: controversial issues and the role of hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 765 (2010).
- Moyer, H. R., Delman, K. A. The role of hyperthermia in optimizing tumor response to regional therapy. Int. J. Hyperthermia. 24, 251 (2008).
- Muthana, M., Multhoff, G., Pockley, A. G. Tumour infiltrating host cells and their significance for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 247 (2010).
- Ostberg, J. R., Repasky, E. A. Comparison of the effects of two different whole body hyperthermia protocols on the distribution of murine leukocyte populations. Int. J. Hyperthermia. 16, 29 (2000).
- Pritchard, M. T. Protocols for simulating the thermal component of fever: preclinical and clinical experience. Methods. 32, 54 (2004).
- Repasky, E. A. Characterization of mild whole-body hyperthermia protocols using human breast, ovarian, and colon tumors grown in severe combined immunodeficient mice. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7, 19 (1999).
- Willnow, U. Treatment of otherwise incurable tumor diseases in childhood using whole-body hyperthermia and chemotherapy. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 208 (1989).
