Summary
Dette notatet beskriver en protokoll for hele kroppen hypertermi hos mus som kan stimulere feber som forhold frem til 12-24 timer.
Abstract
Hypertermi er et generelt begrep som brukes til å definere økningen i kjernen kroppstemperatur over normalen. Det er ofte brukt for å beskrive den økte kjernen kroppstemperatur som er observert i løpet av feber. Bruken av hypertermi som adjuvant har dukket opp som et lovende prosedyre for tumorregresjon innen kreft biologi. For dette formålet, er det viktigste krav til å ha pålitelige og ensartet oppvarming protokoller. Vi har utviklet en protokoll for hypertermi (hele kroppen) hos mus. I denne protokollen, er dyr utsettes for sykluser av hypertermi i 90 min etterfulgt av en hvileperiode på 15 minutter. I løpet av denne perioden mus har lett tilgang til mat og vann. Høy kroppstemperatur toppene i mus under første hypertermi eksponering sykluser er forhindret ved å immobilisere dyret. Tillegg er normalt saltvann administrert i første syklusene for å minimalisere virkningene av dehydrering. Denne protokollen kan simulere feber som forholdene i mus opptil 12-24 timer. Vi harbrukt 8-12 uker gamle BALB / Cj hunnmus å demonstrere protokollen.
Protocol
1. Dyreetikk
Før du utfører den lange varigheten hypertermi på mus sørge for at prosedyren er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. Alle prosedyrene omtalt i denne artikkelen, og vist i vedlagte videoen ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee of National Institute of Immunology.
2. Forstå Hypertermi
Whole Body Hypertermi (WBH) leveres ved å plassere dyrene i forvarmet bur som er plassert i inkubator opprettholdt på 39,5 ° C. Under standardisering av protokollen, ble en temperatursensor implantert i mus og deres kroppstemperatur ble overvåket i forskjellige eksperimentelle betingelser. Det ble observert at ved å plassere dyrene i oppvarmet miljø, deres temperatur økes gradvis fra 37 ° C til opp til 42 ° C over varigheten av 100 min (Figur 1). The resulterende "spike" i temperatur er spennende som den interne kroppstemperaturen skutt enda høyere enn den ytre omgivelsestemperatur.
Når kroppstemperaturen overskredet 40 ° C, ville dyret viser tegn til stress og dehydrering som fukting rundt snuten. Øk kroppstemperatur utover 40 ° C, vil føre til fukting og irreversible stresset eller død av dyr på grunn varmestress. Så det er viktig å hindre at temperaturen toppene i løpet av hypertermi.
Dette fenomenet av høytemperaturkilder spikes er forbundet med fysiske hyperaktivitet av dyr under hypertermi eksponering. Lignende temperatur spikes ble observert av andre grupper også og ble forbundet med den fysiske hyperaktivitet av dyret på blir introdusert til miljøet har høyere temperaturer 10.
I protokollen vår, er mus immobilisert under hypertermi eksponering. Somvist i figur 2, forhindrer immobilisering av dyr temperatur toppene.
Vi har brukt 8-12 uker gamle BALB / Cj mus for å demonstrere denne protokollen. Protokollen er ikke begrenset til en bestemt type / stamme av mus.
3. Forberedelse til Eksperiment
3.1 Inkubator
Dette eksperimentet kan utføres i en vanlig CO 2 inkubator som de har en god temperaturkontroll. Koble CO 2 gassforsyning og fjerne vannet holder skuffen på CO 2 inkubator. I enkelte modeller av inkubatorer er det mulig å slå av CO 2-kontrolleren. Ordne hyllene inkubatoren slik at en mus bur kan plasseres beleilig innsiden. Sette temperaturen inkubatoren ved 39,5 ° C.
3,2 Cages
Vanligvis er hypertermi eksperiment utført på 4 mus ved gangen. To bur er nødvendig, påe er plassert inne i inkubatoren og den andre er plassert utenfor ved romtemperatur. Sengetøy av merdene unngås, som plastrene sengetøy blir våte med tid som resulterer i ikke-jevn temperatur inne i buret. Utenfor buret skal ha mat pellets og vann flaske.
3.3 Mus immobilisering rør
I løpet av første 4 sykluser med hypertermi mus immobilisert i perforerte rør. Disse immobilisering rør kan være laget av 50 ml 'sentrifugerør' rør ved piercing 3 mm hull over sin kropp og fire slike rør vil være nødvendig. Den 50 ml tube kan beleilig immobilisere BALB / Cj mus som er eldre enn 8 uker. Rør av passende størrelse kan være nødvendig for noen uvanlig annen stamme av mus eller mus som er meget ung eller eldre enn 50 uker.
Sted immobilisering rør og et bur inne i inkubatoren opprettholdt på 39,5 ° C. Vente minst 2 time, slik at buret, og jegmmobilization rør oppnå temperaturen inkubatoren.
4. Første syklusen av Hypertermi
Mus kan oppleve dehydrering under hypertermi eksponering. Derfor før du begynner eksperimentet, administrere 0,5 ml vanlig saltoppløsning intraperitonealt til hver mus. Bruk en 26 G kanyle med 1 ml sprøyte.
Raskt ta ut buret plasseres i inkubatoren, stedet en dyr i hver immobilisering rør og plassere buret tilbake i inkubatoren. Registrerer tiden. Det er viktig å holde buret på samme sted i inkubatoren hver gang.
Etter 90 min, ta ut buret fra inkubatoren. Slipp dyr fra immobilisering rør og plassere dem i bur ved normal temperatur med lett tilgang til mat og vann. Plasser tomme immobilisering rør tilbake i kuvøse.
Etter 15 min, blir den andre syklusen av hypertermi startet ved å levere 0.5 ml saltvann intraperitonealt til hver mus.
De blir deretter immobilisert i 50 ml perforerte immobilisering rør og plassert i kuvøse.
5. Påfølgende hypertermi Cycles
For første 4 sykluser, er det viktig å bremse mus under hypertermi eksponering og for de to første syklusene, er saltvann injeksjon gitt før du starter hypertermi perioden.
Etter disse syklusene av hypertermi etterfulgt av resten er ferdig, mus får acclimatize og ikke bli hyperaktive under hypertermi eksponering. Intraperitoneal injeksjon av saltvann kan ikke være nødvendig hvis mus lett ta mat og vann under hviletid.
6. Etter at alle sykluser Fullført, er det siste trinnet for å undersøke Animals
Det bør ikke være noen død under hypertermi sykluser. Alle dyr må bli sett veldig nøye på det førstenoen sykluser. Raskt se etter noen tisse rundt snuten. Dette symptomet er en signatur av dehydrering. Mus med slike symptomer bør umiddelbart gis 0,5 ml fysiologisk saltløsning IP og resten ved romtemperatur. De fleste av de immobiliserte mus vil ikke kreve noen ekstra omsorg og vil lykkes bære stress hypertermi.
Etter å ha fullført nødvendige sykluser, kan dyrene ser svak og dehydrert, men de vil raskt gjenopprette innen få timer.
Figur 1. Variasjon av kjernen kroppstemperatur Mus når buret ble plassert i en inkubator ved 39,5 ° C. Etter 90 min buret ble fjernet fra inkubatoren og plassert ved 25 ° C. Røde sirkler indikerer høy temperatur toppene.
Figur 2. Variasjon av kjernelegemet temperare av en immobilisert Mus løpet hypertermi sykluser. Etter immobilizing dyret ble høye temperaturer pigger ikke observere når buret ble plassert på 39,5 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så langt tilbake som 5000 f.Kr., behandlet egyptiske leger svulster med varme. Grekerne innsett verdien av varme i noen medisinske behandlinger. De eldste tekstene Moseloven omtale hot springs (Genesis 36:24) til terapeutisk heve kroppstemperaturen.
De tidligere teknikker anvendes enten bruk av pyrogene mikrobielle ekstrakter for induksjon av feber eller varme vannbad for induksjon av hypertermi 1. Men ingen av disse tilnærminger kan lett overvåkes eller kontrolleres. I våre protokollen mus utsettes for hypertermi på en kontrollert og reproduserbar måte.
I denne prosedyren er det viktig å holde et øye med mus i løpet av de to første syklusene av hypertermi. I tilfelle deres pels er funnet våt eller overdreven fukting observert rundt snuten, bør de umiddelbart gis hvile og gi vanlig saltoppløsning intraperiotoneally å forhindre dehydrering ved romtemperatur.
telt "> Etter utvinning, kan slike dyr bli utsatt for hypertermi igjen. Det er interessant å observere at etter 3-4 runder med hypertermi fleste mus ikke blir hyperaktive og de aktivt bruker vann og mat under hvileperiode.Noen kliniske protokoller for bruk kunstig indusert hypertermi i behandling av kreft er utviklet i nyere tid 4,9,11. Det er er noen rapporter om bruk av hypertermi i forhold til tumorregresjon 3,5-8,12. I en nyere artikkel, Jia et al. ha brukt mikrobølgeovn varmeovner for å utsette dyr til kort varighet (30 min) hele kroppen hypertermi 5. Den lange varighet (som varer i et par timer) hele kroppen hypertermi er en mer utfordrende prosedyre. Vi har beskrevet en meget enkel og billig protokoll for lang varighet hypertermi eksponering. Det er en veldig lovende verktøy for å utvikle en helhetlig strategi for behandling av kreft. Med større bevissthet på enkelhet og nytte of hypertermi prosedyre, kan det bli mer populært blant forskere og klinikere 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
- Braude, A. I., Beck, J., Zalesky, M. Febrile response to bacterial pyrogens in leukemia. Blood. 16, 1279 (1960).
- Dovern, E. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy added to the treatment of ovarian cancer. A review of achieved results and complications. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 31, 256 (2010).
- Gaworek, J., Mayer, C. T. Systemic whole body hyperthermia in oncology: fatal heat for tumor cells. Pflege. Z. 56, 15 (2003).
- Hegewisch-Becker, S. Effects of whole body hyperthermia (41.8 degrees C) on the frequency of tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced malignancies. Clin. Cancer Res. 9, 2079 ( ).
- Jia, D. Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 27, 275 (2011).
- Maluta, S., Dall'oglio, S., Nadalini, L. Treatment for intermediate and high-risk prostate cancer: controversial issues and the role of hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 765 (2010).
- Moyer, H. R., Delman, K. A. The role of hyperthermia in optimizing tumor response to regional therapy. Int. J. Hyperthermia. 24, 251 (2008).
- Muthana, M., Multhoff, G., Pockley, A. G. Tumour infiltrating host cells and their significance for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 247 (2010).
- Ostberg, J. R., Repasky, E. A. Comparison of the effects of two different whole body hyperthermia protocols on the distribution of murine leukocyte populations. Int. J. Hyperthermia. 16, 29 (2000).
- Pritchard, M. T. Protocols for simulating the thermal component of fever: preclinical and clinical experience. Methods. 32, 54 (2004).
- Repasky, E. A. Characterization of mild whole-body hyperthermia protocols using human breast, ovarian, and colon tumors grown in severe combined immunodeficient mice. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7, 19 (1999).
- Willnow, U. Treatment of otherwise incurable tumor diseases in childhood using whole-body hyperthermia and chemotherapy. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 208 (1989).
