Forward genetik er en stærk metode til at optrævle det molekylære niveau af, hvordan<em> Toxoplasma</em> Egresses fra værtscellen. Protokoller er tilvejebragt til kemisk mutagenisere parasitter, berige for mutanter med defekter i induceret udgang, og validere fænotypen af klonede mutanter.
Den udbredte, obligat intracellulær, protozoparasit Toxoplasma gondii forårsager opportunistisk sygdom i immunsvækkede patienter og forårsager fødselsdefekter på medfødt infektion. Den lytiske replikationscyklus er karakteriseret ved tre faser: 1. aktiv invasion af en nukleeret værtscelle; 2. replikation inde i værtscellen; 3. aktive udgang fra værtscellen. Mekanismen for udstrømning i stigende grad værdsat som en unik, stærkt reguleret proces, som er stadig dårligt forstået på det molekylære niveau. De signalveje ligger til grund for udgang har været karakteriseret ved brug af farmakologiske midler, der virker på forskellige aspekter af de veje 1-5. Som sådan har flere uafhængige udløser udgang blevet identificeret som alle konvergerer på frigivelsen af intracellulære Ca2 +, et signal, som også er kritisk for værtscellen invasion 6-8. Denne indsigt oplyste en kandidat gen, tilgang, som førte til identifikationring af anlæg som calcium-afhængig proteinkinase (CDPK) er involveret i udgang 9. Desuden har flere nylige gennembrud i forståelsen udgang er foretaget ved hjælp af (kemisk) genetiske tilgange 10-12. At kombinere det væld af farmakologiske oplysninger med den stigende genetiske tilgængeligheden af Toxoplasma vi for nylig nedsat en skærm gør det muligt for berigelse for parasittens mutanter med en defekt i værtscellen udgang 13. Selv kemisk mutagenese med N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU) eller ethylmethansulfonat (EMS) er blevet anvendt i årtier i studiet af Toxoplasma biologi 11,14,15, først for nylig har genetisk kortlægning af mutationer ligger fænotyperne blevet rutine 16 -18. Endvidere, ved at generere temperaturfølsomme mutanter, kan vigtige processer udskæres og de underliggende generne identificeres direkte. Disse mutanter opfører sig som vildtype under permissive temperatur (35 ° C), men undlader at proliferate ved den restriktive temperatur (40 ° C) som følge af mutation i spørgsmål. Her viser vi en ny fænotypisk screening fremgangsmåde til at isolere mutanter med en temperaturfølsom fænotype udgang 13. Udfordringen for udgangs skærme er at adskille egressed fra ikke-egressed parasitter, som kompliceres af hurtig re-invasion og generel klæbrighed af parasitterne til værtscellerne. En tidligere etablerede udgang skærm er baseret på en besværlig række biotinyleringsbetingelserne trin til at adskille intracellulær fra ekstracellulære parasitter 11. Denne fremgangsmåde heller ikke generere betingede mutanter deraf i svage fænotyper. Den her beskrevne fremgangsmåde overvinder den stærke binding af træder ud parasitter ved at inkludere en glycan konkurrent, dextransulfat (DS), der forhindrer parasitter i at klæbe til værtscellen 19. Desuden er ekstracellulære parasitter specifikt dræbt ved pyrrolidin dithiocarbamat (PDTC), hvilket efterlader intracellulære parasitteruskadt 20. Derfor, med en ny fænotypisk skærm til specifikt at isolere parasit mutanter med defekter i induceret udgang, kan kraften i genetik nu udnyttes fuldt ud at udrede de molekylære mekanismer, der ligger værtscellen udgang.
Den beskrevne protokol giver en effektiv metode til at isolere Toxoplasma mutanter med en udgang defekt. Vi har med held isoleret mutanter langs forskellige trin udgangsventilen pathway, hvoraf nogle har en dobbelt invasion fænotype 13. Potentielle virkninger på invasion kan bestemmes ved hjælp af den såkaldte rød-grønne analyse, som adskiller invaderede fra ikke-invaderet parasitter ved forskellen antistoffarvning 23,24. For både invasion og afstigning assays kan det være be…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N og National Institutes of Health forskningsbevilling AI081220. BIC er understøttet af en Tempelridderne Eye Foundation forskningsbevilling.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher & Schuell | 110612 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C | |
Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective |
HBSSc (according to Black et al.11):