Summary
Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.
Abstract
Virales adeno-asociados (AAV) vectores representan algunos de los vehículos más potentes y prometedores para la transferencia de gen terapéutico humano debido a una combinación única de propiedades beneficiosas 1. Estos incluyen el apathogenicity de los virus de tipo salvaje subyacentes y las metodologías muy avanzadas para la producción de alto título, de alta pureza y de grado clínico vectores recombinantes 2. Una ventaja adicional particular del sistema de AAV sobre otros virus es la disponibilidad de una riqueza de origen natural serotipos que difieren en propiedades esenciales sin embargo, todos pueden ser fácilmente diseñado como vectores utilizando un protocolo común 1,2. Por otra parte, una serie de grupos, entre ellos el nuestro han creado recientemente las estrategias a utilizar estos virus naturales como plantillas para la creación de vectores sintéticos que, o bien se combinan los activos de los serotipos de entrada múltiples, o que mejorar las propiedades de un solo aislamiento. Las respectivas tecnologías para lograr estos objetivos are ADN de la familia ya sea arrastrando los pies 3, es decir, la fragmentación de los diversos genes de la cápsida AAV, seguida de su nuevo montaje basado en homologías parciales (normalmente> 80% para la mayoría de los serotipos de AAV), o de visualización 4,5 péptido, la inserción es decir, que suele ser de siete aminoácidos en un bucle expuesta de la cápsida viral donde el péptido idealmente media re-dirigida a un tipo de célula deseado. Para el mayor éxito posible, ambos métodos se aplican de un modo de alto rendimiento por el que los protocolos están en mayor escala para producir las bibliotecas de alrededor de un millón de variantes diferentes cápside. Cada clon es entonces compuesto de una combinación única de numerosos virus parentales (ADN enfoque arrastrando los pies) o contiene un péptido distintivo en la columna vertebral misma viral (enfoque pantalla péptido). El paso final es iterativo subsiguiente selección de dicha biblioteca sobre las células diana a fin de enriquecer para cápsidas individuales que cumplan la mayoría o idealmente todos los requisitos del proceso de selección. Este último preferiblemente peineines presión positiva, como el crecimiento en un cierto tipo de células de interés, con selección negativa, por ejemplo la eliminación de todas las cápsidas que reaccionan con anticuerpos anti-AAV. Esta combinación aumenta las posibilidades de que cápsidas sintéticos que sobreviven a la selección coincidan con las necesidades de la aplicación dada de una manera que probablemente no se han encontrado en cualquier forma natural AAV aislar. Aquí, nos centramos en el método de ADN de la familia arrastrando los pies como la teórica y experimentalmente más difícil de las dos tecnologías. Se describe y demostrar todos los pasos esenciales para la generación y selección de las bibliotecas barajan AAV (Fig. 1), y luego discutir las dificultades y los aspectos críticos de los protocolos que hay que tener en cuenta a fin de tener éxito con la evolución molecular de AAV.
Protocol
1. Preparación de los Juegos de plásmido que codifica los genes de la cápsida AAV
- Para facilitar la preparación de rutina de cantidades suficientes de los diversos AAV cápside (PAC) los genes de ADN posterior arrastrando los pies, en un principio subclonar estos genes en un plásmido columna vertebral común. Es importante incluir idénticas secuencias flanqueantes de> 20 nucleótidos para su uso posterior como sitios de unión del cebador para PCR y para la clonación (Fig. 2).
- El uso de primers apropiados (véase el cuadro de cebadores ejemplares para AAV5), amplificar por PCR los genes deseados de cabeza a partir de plásmidos AAV comúnmente disponibles que normalmente contienen el gen de la AAV2 representante de al lado de la tapa del gen de la elección. Debido a que el producto de PCR se utiliza para la clonación estándar, 1 ~ g de producto purificado ya es suficiente, y cualquier protocolo de PCR convencional por lo tanto, se puede utilizar.
- Recopilación de la PCR purificado producto (por ejemplo, el uso de agarosa purificación en gel o un kit estándar de PCR purificación) ydestinatario plásmido con enzimas de restricción cuyo reconocimiento sitios están presentes en los cebadores utilizados para la amplificación tapa (1,1), así como en el receptor plásmido. En nuestro laboratorio, usamos Pac I y Asc sitios I (Fig. 2), ya que están ausentes en la mayoría de las válvulas de ventilación.
2. DNasa con sede en Cap Fragmentación Gene
- Amplificar por PCR los genes de cabeza de la elección de los plásmidos obtenidos en los pasos 1.1-1.3. Una reacción como se describe a continuación dará ~ 3 g de producto de PCR. Dependiendo del número de genes de cabeza para ser incluidos en la biblioteca, esto es suficiente para un máximo de seis reacciones se arrastran.
- Para el PCR, establecer una reacción de 50 l que contiene 200 ng de plásmido la tapa, cada cebador en la concentración de 2 mM final, de 10 l tampón 5x alta fidelidad y 1 l de polimerasa alta fidelidad. Comienza con 5 min a 95 ° C y luego ejecutar 40 ciclos de 15 segundos a 94 ° C, 30 segundos 57 ° C y 3 min 68 ° C, seguido por un paso final de 10 min a72 ° C. Purificar los productos de PCR a través de gel o kit y luego establecer un control resumen DNasa para crear fragmentos de genes de cabeza para volver a montar en quimeras.
- Por lo tanto, igual de mezclar los diferentes productos de la PCR de cabeza a un monto total de 4 g en 54 l de H 2 O. Añadir 6 l tampón de reacción de DNasa y 0,5 l DNasa I a la reacción, cuidadosamente chasquear tres veces, girar brevemente e inmediatamente puesto en un bloque de 25 ° C de calentamiento. Incubar entre 1 y 2 minutos (configurar varias reacciones paralelas y terminan en incrementos de 15 segundos), y luego se detiene la reacción mediante la adición de 6 ml de 25 mM EDTA y con una breve agitación e incubar 10 minutos a 75 ° C.
- Purificar los fragmentos de cabeza en un nivel del 1% en gel de agarosa. Lo ideal sería que una prueba debe ser visible entre 100 y 500 pares de bases. Desde DNasa I es una enzima muy potente, el manejo adecuado y el momento son fundamentales en esta etapa, y múltiples variaciones en el tiempo de incubación en el paso 2.3 puede ser necesaria para resolución óptimaULTS (fig. 3). Se purifica el ADN se eluyó usando un kit estándar y determinar su concentración.
3. ADN Familia Baraja
- En primer lugar, volver a montar los fragmentos de tapa en secuencias de larga duración a través de una PCR en la que se auto-prime sobre la base de homologías parciales. Por lo tanto, establecer una reacción de 50 l con 500 ng de fragmentos purificados (paso 2.4), 10 l de buffer Phusion 10 veces, 1 l de 10 mM dNTPs, 1,5 l de DMSO y 0,5 l de polimerasa Phusion II. Incubar 30 segundos a 98 ° C y luego ejecutar 40 ciclos de 10 segundos 98 ° C, 30 segundos 42 ° C y 45 seg 72 ° C, seguido por un paso final de 10 min a 72 ° C.
- En una subsiguiente segunda PCR, amplificar los genes de cabeza de re-ensamblados para la clonación posterior, usando cebadores que se unen a las secuencias conservadas que flanquean (Fig. 2). Por lo tanto, establecer una reacción de 50 l que contiene 2 l de la primera PCR (paso 3,1), cada cebador a una concentración final de 2 mM, 0,5 l de MgCl2,10 l tampón 5x alta fidelidad y 1 l de polimerasa alta fidelidad. Se recomienda realizar PCR 16-24, para conseguir rendimientos suficientemente altos para la posterior clonación. Reúnase el PCR y purificar la banda de la tapa de cuerpo entero (gel o el kit).
- Compendio de la piscina tapa gen purificado con Pac I y ASC para la clonación en un competente en la replicación de AAV plásmido que lleva AAV RTI (repeticiones invertidas terminales; de replicación y las señales de embalaje), así como el gen AAV2 rep. Este último debe ser seguido por los mismos sitios para dar cabida a la reserva de genes tope "en el marco" (ver fig. 2 para más detalles). Para lograr una digestión completa del producto de PCR, se incuba durante la noche con la enzima de exceso.
- Ligar los fragmentos de cabeza y la columna vertebral adecuadamente cortado AAV ITR / repeticiones en una relación molar 3:1. Hacer un 40 l de volumen total de mezcla maestra (suficiente para 20 transformaciones) con una concentración final de ADN de 50 ng / l, y se incuba durante una noche a 16 ° C.
- Transformar reacción de ligación por mezcla (en hielo) 2 l con 30 l de electro-competentes E. coli (a partir de células comerciales y hechas competentes mediante cualquier protocolo estándar). Agregar en las cubetas de electroporación previamente refrigerada (1 mm de distancia) en el hielo. Electroporar a 1,8 kV, 200 Ω y 25 mF. La constante de tiempo debe estar cerca de 5 ms. Inmediatamente después, añadir 1 ml de pre-calentado medio SOC y transferir a un matraz de 250 ml. 20 electroporaciones estos dará lugar a una biblioteca con una gran diversidad de aproximadamente 1x10 6 diferentes clones.
- Añadir 1 volumen pre-calentado medio SOC a las transformaciones agrupados y agitar a 37 ° C y 180 rpm durante 1 h. Luego abrir el volumen total a 800 ml con medio LB más ampicilina (concentración final de 50 g / ml) e incubar durante 16 h más en las mismas condiciones. Se purifica el ADN plásmido de biblioteca utilizando, por ejemplo. un kit de Qiagen Mega preparación.
Opcional en el paso 3.6: Para calcular la diversidad de la biblioteca exacta, la placa de un aliquOT de la ml de solución 800 (antes de la incubación de 16 h) sobre ampicilina LB-placas (por ejemplo, 10 l sobre una placa de 10 cm) y las colonias cuente el día siguiente. Además, para validar altas eficiencias arrastrando los pies, por ejemplo, secuencia de 24 clones y alinearlos a los genes de los padres de cabeza (ver también la fig. 8). Por último, para confirmar la vitalidad de la biblioteca y la diversidad funcional de alta, subclón elegidos al azar genes de cabeza a un ayudante de AAV plásmido y los utilizan para producir y analizar los vectores recombinantes en pequeña escala (Fig. 4.5) (véase también el paso por debajo de 5,4).
4. Producción de Biblioteca viral
- Semilla 10 15 cm 2 placas de células HEK293T (4.5x10 6 células / placa) y 48 h después transfección con 220 mg AAV biblioteca y 220 microgramos adenoviral plásmido (necesario para la propagación de AAV). Por lo tanto, de pre-calentamiento de PEI (polietilenimina) y 300 mM de NaCl a 37 ° C. A continuación, mezclar 7,9 ml de NaCl y el ADN, y añadir H 2 O para un total volume de 15,8 ml. En un tubo separado, mezclar 3,52 ml de PEI, 7,9 ml de NaCl y 4,38 ml de H 2 O (todos los volúmenes de diez transfecciones). Combinar las mezclas (Vortex) e incube durante 10 min a temperatura ambiente, antes de distribuir la solución uniformemente a través de los platos (3 ml por placa).
- Después de 48 horas, raspar las células en el medio y girar hacia abajo a 1200 rpm durante 15 minutos. Resuspender el sedimento celular en 6 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 50 mM NaHCO 3) y sujeto a 5 ciclos de congelación-descongelación (-80/37 ° C). Incubar con 50 U benzonasa por ml durante 1 hora a 37 ° C, antes de girar hacia abajo los restos de células a 3750 rpm durante 20 min.
- Preparar 15%, 25% y 40% (diluciones con 2,5 l / PHENOLRED ml) de una iodixanol 60% (OptiPrep en PBS-MK) stock en PBS-MK (1x PBS, 1 mM de MgCl 2, 2,5 mM de KCl).
- Establecer un gradiente para la purificación de AAV mediante una pipeta Pasteur de añadir 5 ml de suspensión de virus en un tubo de centrífuga Beckman Quick Seal-(14x89 mm), seguido por 1,5 ml de EACh de 15%, 25% y 40% de solución iodixanol. Arriba de la pendiente con tampón de lisis.
- Ultracentrífuga a 50,000 K durante 2 horas a 4 ° C en un Beckman Ti70.1 del rotor. Luego limpiar el exterior del tubo con 70% de etanol, se adhieren una aguja en la parte superior del tubo de ventilación y extraer 1,2 ml de la fracción iodixanol 40% utilizando una aguja. Tenga cuidado de no llamar de la fracción de 25%, ya que contiene vacíos cápsides AAV.
5. Detección y Selección
- En este punto, uno puede iterativamente amplificar toda la biblioteca en células cultivadas o en los animales hasta cápsidas quiméricas que exhiben propiedades deseadas han surgido (Figs. 6-11).
- Para seleccionar en células cultivadas, co-infectar varias alícuotas de la biblioteca (por ejemplo, 1, 10 y l 100) y adenovirus 5-para apoyar el crecimiento de AAV. Prueba de múltiples variaciones de la biblioteca y el ayudante adenovirus es esencial, ya que la infectividad biblioteca en un determinado tipo de células no se pueden predecir. Se recoge elcélulas después de ~ 3 días, extraer amplificado AAV a través de congelación-descongelación, inactivar adenovirus durante 30 min a 56 ° C y de re-infectar nuevas células. Repetir hasta 5 veces hasta que cápsides distintas enriquecido (validar mediante secuenciación).
- Para la selección de los animales, infectar con la biblioteca y extraer el tipo deseado de tejidos o células después de aproximadamente 1 semana. No co-infectan con el adenovirus ya que esto causará efectos tóxicos adversos en los animales. Rescate del ADN viral mediante PCR utilizando los cebadores mismo que antes (Fig. 2), re-clonar a la piscina gorra, producir una biblioteca fresca y repita hasta que cápsides distintas enriquecido (validar mediante secuenciación).
- Las condiciones exactas (volumen, título, ruta) para la selección in vivo dependerá del tejido diana de interés. Para el hígado, los ratones son típicamente infectado con 1x10 11 a 1x10 12 partículas virales en un volumen total de 200 l de PBS mediante inyección vena de la cola (IV). El factor limitante es generalmente el título viral de la originapreparación l, porque la inyección de 1x10 12 AAV en 200 ul requiere un título de al menos 5x10 12 / ml, no todos los laboratorios que habitualmente puede lograr. Por lo tanto, mientras que un título máximo es beneficioso para la primera infección (debido a que la biblioteca aún no se ha enriquecido para cápsides eficientes en un determinado tejido y por lo tanto puede tener una infectividad general relativamente bajo), le recomendamos utilizar por lo menos 1x10 11 partículas por ratón para la selección de hígado.
- Si los ratones múltiples están disponibles, es muy útil para inyectar diferentes números de partículas semejantes a la selección en células cultivadas, y para utilizar varios ratones por grupo (y, a continuación combinan los hígados recogidos dentro de cada grupo) con el fin de minimizar la variabilidad y para incrementar el éxito las tasas, por ejemplo, tres ratones en 11 1x10 y 1x10 3 ratones a 12 partículas.
- Dado que AAV es un virus no patógeno e incompetentes de replicación (sin helpervirus), no hay reacciones adversas que debe buscar en la ausencia de Adénovirus.
- Para la eutanasia, los animales fueron anestesiados con un vaporizador de isoflurano y, posteriormente, la eutanasia a través de la dislocación cervical.
- Los tejidos (hígado en este caso) se recogieron después los animales fueron sacrificados confirmado. En general, no es necesario también para otros tejidos para perfundir los animales o para cosechar AAV infectadas órganos antes de la muerte, ya que el ADN AAV es estable y puede fácilmente ser rescatado de células congeladas o los tejidos.
- Para el estudio de cápsides individuales (de la biblioteca (paso 3.6) o después de la selección (pasos 5.2-5.3)), producen vectores AAV que codifican un gen reportero (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias 6) siguiendo los pasos 4.1-4.5. Por lo tanto, clonar el gen de la tapa de interés en un estándar ayudante de AAV plásmido 2. En el paso 4.1, triple transfectar las células con 14,7 g cada uno de los vectores AAV (que codifica el reportero), ayudante de AAV y el ayudante adenovirus. Infectar a las células cultivadas o animales con el virus purificado en cantidades diferentes y determinantestransducción de la eficiencia ne por ejemplo, mediante FACS o microscopía.
6. Los resultados representativos
Uso del protocolo descrito aquí típicamente resulta en bibliotecas virales con una diversidad de aproximadamente 1x10 6 cápsidas únicas que pueden ser seleccionados para las partículas individuales más o mostrando todas las propiedades deseadas en una línea celular dado o en animales. En lo que sigue, se proporcionan ejemplos representativos de los resultados de tales in vitro o in vivo en proyecciones.
Antes de eso, sin embargo, consideramos que es importante señalar una vez más la utilidad del análisis de los distintos clones de la biblioteca del plásmido original para su funcionalidad y diversidad (opcional en el paso 3.6). Esto es porque los dos últimos parámetros son máximos requisitos críticos para el éxito de la selección de la biblioteca real viral que se hace de la biblioteca de plásmidos. Por lo tanto, uno puede escoger al azar una sola barajagenes de la tapa y los utilizan para producir vectores AAV recombinantes (extractos crudos o partículas purificadas, en función del grado de precisión deseado) que expresan un gen reportero fácilmente detectables y cuantificables. Un ensayo típico para comparar las variantes diferentes cápside es entonces microscopía de fluorescencia, como se muestra en el ejemplo representativo en la figura. 4.
Un método alternativo es FACS basado en la medición de la expresión del gen indicador fluorescente que tiene las ventajas adicionales que también permite la determinación de la expresión génica por célula, además de que funcione para las células en suspensión. Fig. 5 muestra un resultado típico de tal análisis FACS basado en lisados crudos de vectores AAV en diversos tipos de células.
Debido a que la selección se ha descrito anteriormente de quimeras tope individual es aleatorio y restringido, que por supuesto no es útil como un enfoque real para el enriquecimiento de los candidatos deseados. En su lugar, la selección de la VIbiblioteca de RAL en las células o tejidos en los animales es más apropiado. Como las condiciones y los parámetros pueden variar con cada aplicación, sólo se pondrán de relieve algunas pautas representativos y de los resultados.
La forma más fácil de selección es iterativo ampliación biblioteca en cultivos de líneas celulares o células primarias (paso 5.2). Desde AAV requiere la co-infección por adenovirus para su propagación, las células diana debe ser susceptible de adenovirus. Uno puede crecer y las infectan por ejemplo, en placas de 6 pocillos, que tienen un número suficiente de células por pocillo para asegurar una cobertura completa de la biblioteca. Una segunda idea importante es que el balance de AAV y Adenovirus es delicada, demasiado AAV inhibirá el adenovirus, mientras que un exceso de esta última va a matar a las células (a diferencia de AAV, adenovirus causa infecciones líticas) antes de que las válvulas de ventilación podría replicar.
Sin embargo, dado que la infectividad biblioteca en un determinado tipo de célula es desconocido, la búsqueda de "bueno" AAV: relaciones de adenovirus en elque ambos pueden propagar requiere paralelo pruebas de varias combinaciones de dosis de la biblioteca y el helper adenovírico (por ejemplo, 10:1, 1:1 y 1:10). Una buena medida para la infección por adenovirus potente es la aparición de efectos citopáticos tres días después de la inoculación del virus, evidenciado por redondeo de las células y separar como se ve en la fig. 6. Viceversa, un útil de lectura para la infección por AAV y amplificación es la detección de proteínas de la cápside por Western Blot, utilizando el anticuerpo B1, que reconoce una muy conservadas AAV cápsida epítopo (fig. 7) 7.
Una decisión importante es entonces que se extrae crudo de AAV a recoger para su posterior re-infección de las células frescas (paso 5.2). Idealmente, uno se llevará a aquellos en los que las bandas de la cápside AAV son por lo menos notable (Fig. 7) debido a que estos sugieren una estrecha vinculación genotipo-fenotipo. Esta última describe la situación en la que un genoma que codifica una variante cápsida cierto esen realidad empaquetado en la cápside correspondiente. Para lograr y mantener un estrecho genotipo-fenotipo vinculación es clave para el éxito de selección individuales candidatos virales como a su vez asegura que cápsidas con propiedades deseadas entregar la plantilla genética cognado en las células durante las rondas sucesivas de infección. Por lo tanto, se recomienda recoger los extractos crudos, con expresión de la cápside moderada para la re-infección y de utilizar cantidades mínimas. Juntas, estas dos medidas evitar la sobrecarga de las células recién infectadas con diferentes cápside / genoma combinaciones que podrían perturbar la relación genotipo-fenotipo, una vez que los virus re-infectados empezar a reproducir y reempaque de sus genomas en cápsides no afines.
Además, es crítico para vigilar la diversidad biblioteca durante repetidas rondas infecciones por secuenciación del ADN. Idealmente, se dará cuenta los cambios en la composición de los clones individuales indicativos de selección con éxito, es decir, acumuladores deulación de fragmentos de distintos serotipos y las pérdidas de los demás, como se ejemplifica en la figura. 8. En el caso ideal, sólo unos pocos o incluso un solo clon finalmente se detectó que luego pueden ser analizados como se describió anteriormente. Sin embargo, si no hay cambios se observan al cabo de cuatro o cinco pasajes, ya sea una debe aumentar la presión de selección (ver Discusión) o considerar que la línea celular utilizada puede ser inapropiado, ya que puede ser muy susceptibles a los serotipos demasiados.
Para la amplificación de la biblioteca en vivo (paso 5.3), las mismas normas y consideraciones son aplicables, con dos diferencias fundamentales: En primer lugar, uno no los clones seleccionados al azar de la pantalla en los animales debido a los costos asociados y las consideraciones éticas. En segundo lugar, no se co-infectan con el adenovirus helper, ya que causa efectos secundarios o muerte en los animales, además de la tropismo adenoviral que restringir la selección a las células susceptibles al virus de la ayuda. En su lugar, la biblioteca de AAV se infunde en ªanimales e, rescatados de las células diana y los tejidos mediante PCR (Fig. 9) y luego volver a clonado y vuelva a embalar para una ronda nueva infección. Como con la selección en cultivo, este proceso se repite hasta que los candidatos individuales han surgido.
Independientemente del procedimiento de selección, el paso final es la validación de las variantes enriquecidas cápside en sistemas apropiados. Figs. 10 y 11 muestran ejemplos representativos de nuestra propia selección previa de las quimeras AAV que funcionan excepcionalmente bien en el cultivo de tejidos o en los hígados de los ratones. Como se ve en la fig. 10, un clon particular (AAV-DJ 3) hecho supera a una colección de ocho wildtypes AAV naturales en una amplia gama de líneas celulares. Por último, otro clon seleccionado en las líneas de hepatoma en cultivo presenta un tropismo más alto para el hígado de ratón y, en consecuencia menos fuera de la selección cuando se infunde en la periferia ratones adultos que el control de vectores potentes AAV8 com probado en directoparisón (fig. 11). Tenga en cuenta que si bien es más específico para el hígado, el clon de AAV-DN realidad transduce este órgano un poco menos eficiente que AAV8. En este sentido, AAV-DN es un ejemplo representativo bueno para el resultado de la evolución y la selección de AAV donde los candidatos finales por lo general presentan una serie de propiedades deseadas, pero no son necesariamente perfectos en todos los aspectos.
Figura 1 Esquema:. Sintético AAV ingeniería cápsida vía familiar ADN revolver y posterior selección en células o en animales. Pasos del protocolo se destacan en color gris.
Figura 2. AAV tapa de los donantes de genes y plásmidos receptores utilizados en nuestro laboratorio para la familia de ADN revolver y la generación de la biblioteca. Tenga en cuenta que estos son sólo ejemplos representativos, y que los sitios exactos y secuenciasse pueden personalizar. Nuestra donante básica plásmido se deriva de la comercialmente disponible pBluescript II KS (+) vector que hemos diseñado para contener la unión cebador se muestra, así como los sitios de restricción, representado por las flechas o triángulos, respectivamente. A continuación, clonado los genes de cabeza de AAV serotipos 1-9 (amplificado con los cebadores CAPF / R) en este plásmido, para convertirse en flanqueado por Pac I y Asc sitios de restricción I. Los cebadores T3 y T7 se utilizan para el aislamiento tapa en el paso 2,2, mientras que la amplificación posterior de ensamblados de re-secuencias quiméricas (paso 3,2) se puede realizar utilizando cualquiera de los pares de cebadores SAE / R o CUF / R, o ambos, en una PCR anidada. El receptor plásmido competente en la replicación lleva repeticiones invertidas AAV terminales (RTI, la replicación y las señales de embalaje) que flanquean el gen rep AAV2 bajo el control del promotor AAV p5. Pac I y Asc sitios de restricción I aguas abajo del representante permitir "en el marco de" clonación de la piscina de la baraja genes de cabeza. Lase muestran los sitios de unión de cebadores LSEQ son útiles para la tapa de la secuenciación de genes (paso 3.6).
Figura 3. Ejemplo de DNasa I digestión de los genes de cabeza (AAV2, 8 y 9). Se muestra un gel de agarosa al análisis de electroforesis de los productos de gen tapa digiere utilizando los tiempos indicados incubación diferentes (en minutos: segundos). Carril U muestra la tapa de entrada de la piscina sin digerir fragmento como control. Los tamaños de las bandas de marcadores de ADN en los carriles M son en kilobases. En este ejemplo, ideal digiere se obtuvieron con tiempos de incubación de 1:45 o 2:00 min, lo que produjo el pico predominante preferido alrededor de 100 a 500 pares de bases (recuadro amarillo).
Figura 4. Ejemplo para microscopía basada en el análisis de tres líneas de células humanas infectadas con cinco diferentes recombinantes que expresan YFP he AAVctors (nombres en la parte superior) a base de genes de cabeza barajan seleccionados al azar de una biblioteca original basado en AAV2, 8 y 9.
Figura 5. Ejemplo para FACS análisis basado en cuatro tipos de células infectadas (en la serie de diez diluciones) con 18 diferentes recombinantes que expresan YFP-vectores AAV (nombres en la parte superior, incluidos los de la Fig. 4) hecho con barajan los genes seleccionados al azar de cabeza a partir de una biblioteca original (AAV2, 8 y 9). La expresión se YFP codificados por color para facilitar su visualización. Porcentajes representados son de células transducidas, con lo que siempre negro indica 0% y el blanco el número más alto medido en cada tipo de células. B2 Clon (rojo) es un ejemplo de un clon con una eficacia global de los pobres, como se puede esperar de cápsides no seleccionados. Nótese que el análisis FACS es más sensible y también puede ser utilizado para las células en suspensión (tal como SupT1) que son menos susceptibles a la microscopía. Hu, Humano; mu, murino.
Figura 6. La apariencia típica de los efectos citopáticos en las células (HeLa, en este caso), después de la co-infección productiva con AAV y Adenovirus. Las células se dejaron sin infectar (panel superior izquierdo) o infectadas con las cantidades indicadas (partículas por célula) de adenovirus.
Figura 7. Detección de expresión AAV proteína de la cápside por Western Blot como una medida para la infección biblioteca y amplificación. La mancha izquierda muestra las células co-infectadas con varios volúmenes (en l) de una biblioteca de AAV y adenovirus helper. Los primeros dos carriles son buenos ejemplos de cooperaciónnditions dando la expresión de la proteína AAV apenas perceptible, lo que indica infección por AAV suficiente pero no excesiva y la amplificación y de ahí la deseada vinculación estrecha relación genotipo-fenotipo. Así, l 0,1, 1 o 10 de estos sobrenadantes se utilizaron para la re-infección de células frescas (mancha a la derecha). Las células en carril C fueron infectadas con AAV solo como un control negativo (sin expresión detectable debido a la ausencia de la helpervirus).
Comparaciones Figura 8. De secuencias de proteínas (los números son aminoácidos) de los clones de AAV de una biblioteca basado en AAV2, 8 y 9 antes y después de la selección. Secuencias por encima de la línea roja muestra las válvulas de ventilación padres. Flechas púrpuras indican los eventos de recombinación homóloga. La flecha roja marca un cruce entre AAV2 y AAV9 observó en todos los clones seleccionados.
Figura 9. </ Rescate strong> de los clones de AAV infectada con éxito a partir de tejidos de ratón a través de PCR. En este ejemplo, los genes AAV tapa eran amplificado por PCR a partir de hígados de ratón se extrajo una semana después de la infusión biblioteca periférico, con par de cebadores SAE / R (fig. 2). El carril 1 muestra el esperado 2,2 kilobases banda, mientras que el carril 2 es un control no plantilla. Tras Pac I y restricción Asc I, los fragmentos amplificados se re-clonado en el plásmido receptor original (fig. 2) para la producción posterior y re-infusión de una biblioteca de secundaria. Los tamaños de las bandas de marcadores de ADN en M carriles se indican en kilobases.
Figura 10. Ejemplo para un rendimiento superior de un AAV enriquecido quimera en células cultivadas. Clon AAV-DJ ha sido reportado por nosotros antes de 3, sino que en su mayoría representa un híbrido entre los serotipos de AAV 2, 8 y 9, y ha sido seleccionado de una bibliotecaria y que contiene estos tres serotipos más cinco adicionales en células de hígado humano en presencia de antisueros humano agrupado. Para comparar su eficacia a ocho naturales serotipos AAV (indicado por 1-6, 8 y 9 en la parte superior), todos los genes tapa se utiliza para producir purificó auto-complementarias que expresan GFP-vectores 8,19. Estos se normalizaron para contener 2x10 9 genomas vector por ml y luego se usa para transducir las líneas de células se muestran en diez veces diluciones seriadas. Tres días más tarde, GFP-expresando las células se contaron y se determinaron los títulos infecciosas teniendo en cuenta el factor de dilución. En contraste con el código en la figura. 5, los colores más oscuros indican mayores aquí infectividad por el número de partículas. Como es evidente, el seleccionado AAV-DJ quimera supera a todos los wildtypes AAV naturales, que ejemplifica el éxito del esquema de selección aplicado. FIBR, fibroblastos, ha, hámster, hu, los humanos, mu, murinos, si, los simios.
Figura 11. Ejemplo para el análisis de un AAV seleccionado quimera en el hígado de ratón. Clon AAV-DN fue seleccionada en células de hepatoma murino y luego se usa para producir vectores recombinantes que expresan luciferasa-8. Se muestran los ratones representativos (tres por grupo) una semana después de la perfusión periférica de dosis iguales de este vector, o un control basado en wildtype AAV8, uno de los más potentes que se conocen cepas naturales en el hígado del ratón 9. Obsérvese que mientras que el clon de AAV-DN da expresión ligeramente menos en total en el hígado (el panel (I)), es más específico para este órgano ya que exhibe sustancialmente menor fuera de la orientación en los tejidos no hepáticos una vez que los niveles de expresión del hígado han sido ajustarse a través del software de imágenes (panel (II)).
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Discussion
En este sentido, hemos delineado los pasos esenciales de experimentación y directrices para la AAV cápside de ingeniería a través de la familia de ADN revolver y para la evolución de las células o en animales. En esencia, estos protocolos son versiones estándar de los procedimientos se informó por primera en el campo de AAV en 2008 3. Mientras que un aluvión de estudios de seguimiento por otros han informado de numerosas modificaciones, por ejemplo, 10-13, nuestras versiones actuales representan estrategias básicas que dan resultados reproducibles, mientras que siendo susceptible de aumento de escala y la adaptación a cualquier necesidad.
A pesar de nuestros esfuerzos para normalizar todo el procedimiento, algunos pasos todavía requieren enfoques de ensayo y error de base. Esto se aplica particularmente a la fragmentación del gen tapón debido al hecho de que DNasa I es muy sensible a las condiciones de reacción, tales como el tiempo de incubación (véase los ejemplos en la figura. 3). Se obtienen los mejores resultados con fragmentos de partida en un rango de100 a 500 pares de bases y, por tanto recomiendan para tratar diversas condiciones DNasa (por ejemplo, las cantidades de la enzima y los tiempos de incubación) hasta que la imagen de gel se asemeja a los carriles de caja en la figura. 3.
Asimismo, es imposible normalizar completamente los pasos individuales durante la selección de biblioteca en cultivo celular. Como se mencionó, un aspecto crítico es la incertidumbre sobre la infectividad de una nueva biblioteca o de adenovirus en un determinado tipo de células, lo que requiere medidas indirectas, como el Western Blot descrito. Por casualidad, en base a nuestra experiencia, la búsqueda de "buenas" AAV / Adenovirus volúmenes de inoculación por lo general sólo dura unos pocos esfuerzos paralelos.
Consideraciones similares se aplican a la selección de la biblioteca de AAV en los animales que también implica idealmente prueba simultánea de varios parámetros (por ejemplo, las dosis de la biblioteca vírica, punto momento de la cosecha después de la inoculación, la vía de inyección) debido a una falta de opciones experimentales para la predicción directamentet biblioteca infectividad in vivo. En general, es importante señalar que en la selección in vivo es generalmente mucho más fisiológicamente relevantes, por varias razones, incluyendo la discrepancia bien conocida entre infectividad AAV in vitro e in vivo 3. Además, en la evolución in vivo permite a infundir la biblioteca de la misma manera que en última instancia, se utilizará en un entorno clínico. Esto proporciona la oportunidad no sólo de enriquecer cápsides que potencialmente infectar a un tipo celular deseado, pero es importante hacerlo desde una ruta de entrega aceptables.
Independientemente del sistema de selección, por lo general consideran que es preferible combinar presiones positivas y negativas, ya que aumentará las posibilidades de enriquecimiento de los candidatos individuales. Una razón para esto último es la probabilidad de que únicamente cápsidas seleccionado bajo presión positiva (por ejemplo, el crecimiento en un cierto tipo de célula) también pueden todavía potentemente infectar células compartir otro (uno) receptor celular (s). Una segunda razón es que el tipo de célula de destino ya podría ser susceptible a los virus de entrada de varios de la biblioteca, la reducción de posibilidades para enriquecer cápsides aún más eficientes en la ausencia de presión negativa adicional.
Un ejemplo de esto último lo que hemos utilizado con éxito antes de que la biblioteca es la amplificación en presencia de antisuero humano combinado que contiene anticuerpos contra los serotipos de AAV que son frecuentes en la población humana. A diferencia de los procedimientos de selección menos estrictas aplicadas en paralelo, sólo que esta combinación de presión positiva y negativa nos permitió extraer un único clon (AAV-DJ, fig. 10) fuera de una biblioteca de aproximadamente 7x10 5 variantes 3.
En cualquier caso, queremos reiterar la importancia de probar múltiples cápsides de plomo que salen de un esquema de selección, y no sólo el principal candidato. De hecho, es bien posible que la mayoría de los clones de la segunda o tercera dominantes son igualmente o incluso mmineral útil que el candidato plomo y / o pueden exhibir fenotipos más deseables para la aplicación dada. Tenemos por lo tanto, recomendamos elegir siempre al menos dos cápsides más de la lista definitiva de candidatos después de la finalización de un protocolo de selección y para estudiar como se indica en el paso 5.4.
Por último, pero no menos importante, queremos reiterar que el ADN de la familia arrastrando los pies no es el único método de AAV de la ingeniería. Enfoques alternativos incluyen la introducción de mutaciones puntuales al azar en un gen particular, la tapa a través de AAV propensa a errores de PCR 14,15, así como la visualización de bibliotecas de péptidos en las áreas expuestas de un AAV específico cápside 4,5. Mientras que un amplio debate o la comparación de estos enfoques se pueden encontrar en otras partes 16-18, fácilmente podemos concluir que, en vista de esta plétora de opciones, el futuro para el campo de la ingeniería de AAV y la evolución es sin duda muy brillante y probablemente ha hecho más que empezar .
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo sobresaliente de su laboratorio, los miembros del equipo y el trabajo del Cluster de Excelencia CellNetworks la Universidad de Heidelberg, así como por la Chica y Heinz Schaller (CHS) fundación. Somos conscientes de que la evolución molecular de AAV a través del ADN de la familia arrastrando los pies se ha convertido en un campo muy activo desde nuestra primera publicación hace tres años y por lo tanto, pedir disculpas a todos los autores de las publicaciones pertinentes, cuyo trabajo no podría ser citado aquí, debido a limitaciones de espacio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
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