الهندسة وتطور فيروس الغدة اسوشيتد الاصطناعية (AAV) المتجهات العلاج الجيني عن طريق الحمض النووي العائلة الخلط
Summary
علينا أن نبرهن التقنية الأساسية لهندسة جزيئيا وتتطور الغدة المرتبطة الفيروسية الاصطناعية العلاج الجيني (AAV) ناقلات عن طريق الحمض النووي عائلة خلط. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم مبادئ توجيهية عامة وأمثلة لاختيار ممثل وتحليل capsids خيالية فردية مع خصائص محسنة على الخلايا المستهدفة في الثقافة أو في الفئران.
Abstract
الغدة المرتبطة الفيروسية (AAV) النواقل وتمثل بعض من أكثر السيارات قوة واعدة لنقل الجينات العلاجية الإنسان نتيجة لمزيج فريد من الخصائص المفيدة 1. وتشمل هذه apathogenicity من الفيروسات wildtype الكامنة ومنهجيات متقدمة للغاية لإنتاج عالية عيار، نقاء عالية والسريرية الصف ناقلات المؤتلف 2. وثمة ميزة أخرى خاصة من خلال نظام AAV الفيروسات الأخرى هو توفر ثروة من الأنماط المصلية التي تحدث بشكل طبيعي والتي تختلف في الخصائص الأساسية حتى الآن يمكن أن تكون جميع هندسيا بسهولة كما ناقلات باستخدام 1،2 بروتوكول مشترك. وعلاوة على ذلك، قد وضعت عددا من المجموعات بما فيها منطقتنا مؤخرا استراتيجيات لاستخدام هذه الفيروسات الطبيعية كقوالب لإنشاء ناقلات الاصطناعية التي تجمع بين أي من أصول الأنماط المصلية مدخلات متعددة، أو التي تعزز خصائص عزل وحيد. التقنيات ذات الصلة لتحقيق هذه الأهداف ARه إما خلط الدنا العائلة 3، أي تجزئة مختلف الجينات قفيصة AAV يليه التجمع إعادة الخاصة بهم على أساس homologies جزئي (عادة> 80٪ لمعظم الأنماط المصلية AAV)، أو عرض 4،5 الببتيد، إدخال أي من الأحماض الأمينية عادة من سبعة إلى حلقة المكشوفة من قفيصة الفيروسية حيث الببتيد يتوسط مثالي إعادة الاستهداف إلى نوع من الخلايا المطلوبة. لأقصى قدر من النجاح، وتطبق كل الأساليب بطريقة عالية الإنتاجية التي يتم من خلالها البروتوكولات تصل إلى تحجيم تسفر عن المكتبات من المتغيرات نحو مليون قفيصة متميزة. وتتألف ثم كل نسخة من مزيج فريد من الفيروسات العديدة الأبوية (DNA خلط نهج) أو يحتوي على الببتيد مميزة داخل العمود الفقري للفيروسات نفسها (الببتيد نهج العرض). الخطوة اللاحقة النهائي هو اختيار متكررة من مكتبة من هذا القبيل على الخلايا المستهدفة من أجل إثراء للفرد capsids الوفاء معظم أو من الناحية المثالية جميع متطلبات عملية الاختيار. ويفضل هذا الأخير مشطإيناس ضغط إيجابي، مثل النمو على نوع معين من الخلايا الفائدة، مع اختيار سلبي، للقضاء على سبيل المثال من جميع capsids التفاعل مع المضادة للAAV الأجسام المضادة. هذا المزيج الذي يزيد من احتمالات أن capsids الاصطناعية على قيد الحياة في اختيار تطابق احتياجات تطبيق معين بطريقة ربما لا يكون قد تم العثور عليها في أي AAV التي تحدث بشكل طبيعي عزل. هنا، ونحن نركز على الحمض النووي طريقة عائلة خلط كما نظريا وتجريبيا أكثر تحديا من التقنيات اثنين. وصفنا وشرح جميع الخطوات الضرورية لتوليد واختيار المكتبات AAV تعديلا (الشكل 1)، ومن ثم مناقشة المخاطر والجوانب الهامة من البروتوكولات التي يحتاج المرء أن يكون على علم لكي تنجح مع تطور AAV الجزيئية.
Protocol
Discussion
هنا، وقد أوجزنا الخطوات التجريبية الأساسية والمبادئ التوجيهية لAAV قفيصة الهندسية عن طريق الحمض النووي الأسرة وخلط للتطور في الخلايا أو في الحيوانات. في جوهره، وهذه البروتوكولات هي إصدارات موحدة من الإجراءات نحن لاول مرة في مجال AAV في 2008 3. في حين أن سلسلة من درا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين الامتنان الدعم المعلقة من مختبرهم، أعضاء الفريق والعمل الذي قامت به الكتلة من CellNetworks التميز في جامعة هايدلبرغ، وكذلك من تشيكا وهاينز شالر (CHS) الأساس. نحن نقدر أن تطور AAV الجزيئية عن طريق الحمض النووي عائلة خلط أصبح حقل نشط جدا منذ نشر موقفنا المبدئي منذ ثلاث سنوات وبالتالي الاعتذار لجميع الكتاب من المنشورات ذات الصلة العمل الذي لا يمكن ونقلت هنا بسبب ضيق المساحة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
