Protokollen beskriver en effektiv og reproduserbar modellsystem for å studere herpes simplex virus type 1 (HSV-1) ventetid og reaktivering. Analysen benytter homogene sympatiske nevroner kulturer og åpner for molekylær disseksjon av virus-Nevron interaksjoner med en rekke verktøy, inkludert RNA interferens og uttrykk av rekombinante proteiner.
Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) etablerer en livslang latent infeksjon i perifere nevroner. Dette latent reservoaret er kilden til tilbakevendende reaktivering hendelser som sikrer overføring og bidra til klinisk sykdom. Gjeldende antivirale ikke påvirke latente reservoaret og det er ingen vaksiner. Mens de molekylære detaljene i lytisk replikasjon er godt karakterisert, mekanismer som kontrollerer ventetid i nerveceller forblir unnvikende. Vår nåværende forståelse av ventetid er avledet fra in vivo studier med små dyremodeller, som er blitt uunnværlige for å definere virale genet krav og rollen immunreaksjoner. Imidlertid er det umulig å skille spesifikke effekter på virus-nervecellen forholdet fra mer generelle konsekvenser av infeksjon mediert av immun eller ikke-nevronale støtte celler i levende dyr. I tillegg er dyreforsøk kostbart, tidkrevende, og begrenset i forhold til tilgjengelige alternativer for å manipulere vertenprosesser. For å overvinne disse begrensningene, er et nevron-eneste systemet desperat behov som gjengir in vivo egenskaper ventetid og reaktivering, men tilbyr fordelene med vevskultur i form av homogenitet og tilgjengelighet.
Her presenterer vi en in vitro modell utnytte dyrkede primære sympatiske nerveceller fra rotte overlegen cervical ganglier (SCG) (figur 1) for å studere HSV-1 latens og reaktivering som passer de fleste om ikke alle de ønskede kriterier. Etter å eliminere ikke-nevronale celler, blir nær-homogene TrkA + Nevron kulturer infisert med HSV-1 i nærvær av acyclovir (ACV) å undertrykke lytisk replikasjon. Etter ACV fjerning, ikke-produktive HSV-1 infeksjoner som trofast stiller akseptert kjennetegner latency er effektivt etablert. Spesielt, lytiske mRNAs, proteiner og smittsomme virus blir umulig å oppdage, selv i fravær av utvalget, men latency-assosiert karakterutskrift (LAT) Expression vedvarer i nevronale kjerner. Viral genomer opprettholdes på et gjennomsnittlig eksemplar antall 25 per nevroner og kan bli overtalt til produktivt replikere ved å forstyrre PI3-Kinase / Akt signal eller den enkle uttak av nerve growth factor 1. En rekombinant HSV-1 koding EGFP smeltet til viral lytisk protein Us11 gir en funksjonell, real-time markør for replikering følge av reaktivering som er lett tallfestes. I tillegg til kjemiske behandlinger, kan genetiske metoder som RNA-interferens eller genet levering via lentiviral vektorer være vellykket brukes på systemet tillater mekanistiske studier som er svært vanskelig, om ikke umulig, i dyr. Oppsummert gir SCG-baserte HSV-1 latency / reaktivering system en kraftig, nødvendig verktøy for å avdekke molekylære mekanismer som styrer HSV1 ventetid og reaktivering i nevroner, et langvarig puslespill i virologi hvis løsning kan tilby ny innsikt i å utvikle nye behandlingsformer som mål than latent herpesvirus reservoaret.
Dette primære neuron kultur og infeksjon systemet gir en enkel og effektiv metode for å utforske de molekylære mekanismene bak HSV-1 ventetid og reaktivering. Systemet trofast sammenfatter de aksepterte kjennetegner ventetid definert i både menneskelige infeksjoner og i live-dyremodeller. Når viruset er latent i SCG kulturer, kan smittsomme partikler og virale lytiske genprodukter ikke bli oppdaget. Den eneste viral genproduktet oppdaget i latent-infiserte nevroner er den ikke-kodende LAT avskrift,…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker leserne for sine gjennomtenkte forslag som bidro til å forbedre dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) og IM (AI073898, GM056927) fra NIH. MK ble støttes delvis av en NIH trening stipend (5T32 AI007180).
Reagent | Company | Catalog# | Comments |
70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |