O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.
Herpes simplex virus tipo-1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente ao longo da vida em neurónios periféricos. Este reservatório latente é a fonte de eventos de reactivação recorrentes que assegurar a transmissão e contribuir para doença clínica. Antivirais atuais não impactar o reservatório latente e não existem vacinas. Embora os detalhes moleculares de replicação lítica são bem caracterizados, mecanismos de controle de latência nos neurônios permanecem ainda desconhecidos. A nossa compreensão actual de latência é derivado a partir de estudos in vivo utilizando modelos animais pequenos, que têm sido indispensáveis para definir os requisitos de genes virais e do papel de respostas imunes. No entanto, é impossível distinguir efeitos específicos sobre a relação vírus neurónio-a partir de consequências mais gerais de infecção mediada por células de suporte imunes ou não-neuronais em animais vivos. Além disso, a experimentação animal é dispendiosa, morosa, e limitado em termos de opções disponíveis para a manipulação de acolhimentoprocessos. Para superar essas limitações, um sistema de neurônios-só é desesperadamente necessário que reproduz a características in vivo de latência e reativação, mas oferece os benefícios da cultura de tecidos em termos de homogeneidade e de acessibilidade.
Apresentamos aqui mais um modelo in vitro utilizando culturas de neurónios simpáticos primárias a partir de gânglios rato cervical superior (SCG) (Figura 1) para estudar o HSV-1 latência e reactivação que se encaixa se não de todos os critérios desejados. Depois de eliminar células não-neuronais, perto homogéneos TrkA culturas + de neurónios são infectadas com HSV-1 na presença de aciclovir (ACV) para suprimir a replicação lítica. Remoção ACV seguinte, não produtivos HSV-1 infecções que exibem características fielmente aceites de latência são eficientemente estabelecida. Notavelmente, os mRNAs líticas, proteínas, e vírus infeccioso tornar-se indetectável, mesmo na ausência de selecção, mas a latência associada transcrição (LAT) expressaion persiste em núcleos neuronal. Genomas virais são mantidas a um número de cópias médio de 25 por neurónio e podem ser induzidas a produtivamente replicar por interferir com PI3-quinase / sinalização Akt ou a retirada simples do factor de crescimento do nervo 1. Um recombinante HSV-1 EGFP codificação fundido com a proteína viral lítica US11 fornece um funcional, marcador de tempo real para a replicação resultante da reactivação que é facilmente quantificado. Além disso a tratamentos químicos, as metodologias genéticas tais como a entrega de RNA-interferência ou gene através lentivirais pode ser aplicado com sucesso para o sistema que permite estudos mecanísticos que são muito difíceis, se não impossível, em animais. Em resumo, a SCG baseado HSV-1 sistema de latência / reativação fornece uma poderosa ferramenta necessária para desvendar os mecanismos moleculares que controlam HSV1 latência e reativação de neurônios, um enigma de longa data em virologia cuja solução pode oferecer novas perspectivas no desenvolvimento de novas terapias que alvo tele latente reservatório herpesvírus.
Esta cultura neurônio primário e sistema de infecção fornece um método simples e eficaz para explorar os mecanismos moleculares subjacentes HSV-1 latência e reativação. O sistema fielmente recapitula as características aceitas de latência definidos em ambas as infecções humanas e em modelos de animais vivos. Quando o vírus é latente nas culturas SCG, partículas virais infecciosas e produtos de genes líticas não pode ser detectado. O produto do gene virai detectado apenas em neurónios l…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos revisores por suas sugestões inteligentes que ajudaram a melhorar este manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões para MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) do NIH. MK foi apoiado em parte por um treinamento NIH subvenção (5T32 AI007180).
Reagent | Company | Catalog# | Comments |
70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |