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Immunology and Infection

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

El protocolo se describe un sistema modelo eficiente y reproducible para estudiar virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) latencia y reactivación. El ensayo emplea cultivos de neuronas simpáticas homogéneos y permite la disección molecular de las interacciones neurona-virus utilizando una variedad de herramientas incluyendo la interferencia de ARN y la expresión de proteínas recombinantes.

Abstract

El virus herpes simple tipo-1 (VHS-1) establece una infección latente de por vida en las neuronas periféricas. Este reservorio latente es la fuente de eventos de reactivación recurrentes que garantizar la transmisión y contribuir a la enfermedad clínica. Antivirales actuales no afectan el depósito latente y no existen vacunas. Si bien los detalles moleculares de la replicación lítica son bien caracterizados, los mecanismos de control de la latencia en las neuronas siguen siendo esquivas. Nuestra comprensión actual de la latencia se deriva de los estudios in vivo con modelos de animales pequeños, que han sido indispensables para definir los requisitos de genes virales y el papel de la respuesta inmune. Sin embargo, es imposible de distinguir efectos específicos sobre la relación de virus neurona de consecuencias más generales de infección mediadas por las células inmunes de apoyo o no neuronales en los animales vivos. Además, la experimentación con animales es costoso, consume mucho tiempo, y limitado en términos de las opciones disponibles para la manipulación de acogidaprocesos. Para superar estas limitaciones, un sistema de neuronas sólo se necesita desesperadamente que reproduce el de las características in vivo de la latencia y reactivación, pero ofrece las ventajas del cultivo de tejidos en términos de homogeneidad y la accesibilidad.

La mayor parte Aquí se presenta un modelo in vitro utilizando cultivos de neuronas simpáticas de rata primaria superior, ganglio cervical (SCG) (Figura 1) para estudiar el VHS-1 de latencia y reactivación que se adapte a si no todos los criterios deseados. Después de eliminar las células no neuronales, casi homogéneas TrkA + cultivos de neuronas están infectadas con HSV-1 en presencia de aciclovir (ACV) para suprimir la replicación lítico. Tras la eliminación de ACV, no productivas las infecciones por HSV-1 que presentan fielmente características aceptadas de latencia se estableció de manera eficiente. En particular, los ARNm líticas, proteínas, y el virus infeccioso hace indetectable, incluso en ausencia de selección, pero asociado a la latencia-transcripción (LAT) expresanión persiste en los núcleos neuronales. Genomas virales se mantienen a un número de copias promedio de 25 por neurona y pueden ser inducidas a replicar productivamente al interferir con la PI3-quinasa / señalización Akt o la simple retirada de factor de crecimiento nervioso 1. Un recombinante VHS-1 EGFP codificación fusionada a la proteína viral lítico US11 proporciona una funcional, en tiempo real para la replicación marcador resultante de reactivación que es fácilmente cuantificado. Además de los tratamientos químicos, metodologías genéticas tales como la interferencia del ARN o el gen de entrega a través de vectores lentiviral puede aplicarse con éxito al sistema de estudios sobre el mecanismo que permite que son muy difíciles, si no imposible, en los animales. En resumen, el SCG-basado en el VHS-1 latencia / reactivación del sistema proporciona una herramienta poderosa, necesaria para desentrañar los mecanismos moleculares que controlan la HSV1 latencia y reactivación de las neuronas, un enigma de larga data en virología, cuya solución puede ofrecer nuevas ideas en el desarrollo de nuevas terapias que objetivo tse reserva latente virus del herpes.

Protocol

1. Aislamiento y cultivo de neuronas SCG de embriones de rata

Para proporcionar un contexto útil para la comprensión de este protocolo, y para una discusión exhaustiva de la literatura antes que los métodos establecidos de la cultura de las neuronas SCG, incluyendo la base de la CGS en el cultivo in vitro, el revestimiento de sustratos de placas, y los componentes del suero libre de los medios de comunicación, la se remite a las referencias 2-4.

  1. El uso de ratas como una fuente para las neuronas SCG se realizó de conformidad con las directrices de los NIH en virtud de un protocolo activo aprobado por el Comité Institucional de Uso y Comisión (IACUC).
  2. Antes de comenzar la disección, preparar el colágeno y la laminina recubierto de 96 pocillos de cultivo de tejidos. Utilizando un dispositivo de pipeteo multicanal, llenar todos los 96 pozos con una solución que contenía 0,66 mg / ml de colágeno de cola de rata. Inmediatamente retirar el colágeno, que pueden ser recuperados y utilizados para hasta 8 disecciones. Después de retirar tque el colágeno, que es muy importante para dejar que los pozos seco bajo una campana de flujo laminar. La cantidad de tiempo que se tarda en secar depende del número de pozos en el plato. Por ejemplo, se toma típicamente aproximadamente 5-10 minutos. para los pozos de una placa de 96 pocillos se sequen, pero puede tomar hasta 30 - 40 min si es un formato más extenso con 24 platos y se utiliza. Si no se seque correctamente los resultados de los pozos en apego SCG pobres. A continuación, repita el procedimiento usando una solución de 2 mg / ml de laminina. Incubar la solución laminina de al menos 2 horas a 37 ° C en un humidificado incubadora de CO 2 hasta que esté listo a la placa de las neuronas (paso 1,14).
  3. Comercialmente obtenidos ratas hembras embarazadas son sacrificados con el CO 2. Después de pulverizar el cadáver con etanol al 70%, una incisión en forma de U se hace alrededor del abdomen. Después de pelar la piel, una segunda incisión en forma de U se realiza a través de la pared muscular abdominal. El útero es visible al levantar la capa muscular abdominal. Extirpar el útero y el lugar en un 15cm plato. Abra cuidadosamente el útero utilizando una tijera roma para evitar daños a las crías en su interior. Cada cachorro debe ser liberado de su saco embrionario, el cordón umbilical cortado, y el cachorro de limpiar con un 70% de etanol y Kimwipes.
  4. Trabajar en una campana de la disección, el sacrificio por nacer las crías de rata E21 por cizallamiento de la cabeza del torso. Apunte las tijeras en la base del cuello, justo encima de los hombros. Para acceder a los ganglios, precisar la cabeza (el cuello hacia arriba) con 23 agujas G en tres lugares: i) de la médula espinal, ii) la piel anterior, se detuvo sobre la nariz y la cubrió, y iii) el esófago / tráquea debe ser depositado lejos a partir de la base del cuello.
  5. Busca el * SCG dos situados a ambos lados de la bifurcación de la arteria carótida (dos SCG por embrión). La SCG se encuentra justo debajo de la rama. Separe el SCG de las arterias, tirando de la bifurcación de distancia. Coloque los ganglios en 12 ml de L15-media (suplementado con 0,4% de D (+)-glucosa) en 15 ml tubo cónico en hielo.

* El SCG es transparente e incolora en comparación con el tejido opaco, tejido adiposo amarillento que rodea la bifurcación. Trate de eliminar la mayor cantidad de los residuos adiposos tejidos y vasos sanguíneos, antes de recoger los ganglios.

  1. Repita el 1,4 y el 1,5 hasta que todos los SCG son cosechadas de los embriones.
  2. Suavemente centrifugar los ganglios durante 1 minuto a 600 rpm y aspirar el exceso de medios.
  3. Resuspender los ganglios en 1 ml de L15-tripsina que contiene medios (0,25%, sin EDTA) y colagenasa (1 mg / ml). Incubar durante 30 min a 37 ° C, agitar cada 10 min.
  4. Añadir 10 ml de C-media (1x MEM, 0,4% de D (+)-glucosa, 2 mM de L-glutamina, FBS al 10%) para inactivar la tripsina y se centrifuga durante 1 minuto a 600 rpm.
  5. Eliminar la mayor parte de los medios de tripsina / colagenasa * como sea posible y lave los ganglios con 10 ml de C-media. Centrifugar durante 1 minuto a 600 rpm. Repita este paso una vez.

Colagenasa * residual interfere con el sustrato de colágeno necesario para la fijación de células en la placa de cultivo.

  1. Retire el papel de lavado y vuelva a suspender los ganglios en 1 ml de C-media y triturar con la aguja 21 G conectada a una jeringa de 5 ml de disociar grandes cúmulos de células *. Finalizar triturando con la aguja 23 G hasta que los grumos visibles son disociados.

* Tenga cuidado de no sobre-triturado, ya que podría dañar las células. Si la tripsina y colagenasa tratamiento tuvo éxito, un máximo de quince arriba y hacia abajo con los ciclos de la aguja 21 G, y tres ciclos con la aguja 23 G debe ser suficiente.

  1. Filtrar las neuronas disociadas a través de un filtro de nylon 70 micras [BD Biosciences células colador] en un tubo cónico de 50 ml para descartar los grupos restantes.
  2. Retirar una alícuota de 10 l de la suspensión celular se filtró y se mezcla con azul de tripano para determinar el número de células vivas. Cuente el número de células que se activa exclude el tinte utilizando un hemocitómetro.
  3. Eliminar la solución de laminina de los 96 platos, así que esperan en la incubadora a 37 ° C (ver Paso 1.2). No seque el plato, que puede ser utilizado inmediatamente para células en placas una vez que la laminina se elimina. * Los Dispense 5000-6000 el total de células vivas, desde 50 hasta 100 l por pocillo) en el colágeno y laminina precubierto 96 platos de cultivo de tejidos. Incluye 50 ng / ml de factor de crecimiento nervioso (NGF) en la C-media.

* Es crítico para emplear una buena técnica estéril de cultivo de tejidos porque los antibióticos se omiten en los medios de crecimiento. Además, puede haber una variabilidad significativa entre el colágeno proceden de diferentes proveedores. Hemos tenido resultados consistentes a través de lotes con colágeno de cola de rata de Millipore.

  1. En DIV (días in vitro) 1, reemplazar los C-medios utilizados para la placa de las células con 50 NBM l (0,4% de D (+) - glucosa, 2 mM de L-glutamina, B-27 suplemento que contenía 50 ng / ml de NGF, 5afidicolina mM y 20 mM de 5-fluorouracilo [5-fluoro-2'-desoxiuridina]. Los cultivos se incuban durante 5 días *. En este punto, trypsinizing y contando las células que quedan en varios pozos puede determinar el número de neuronas supervivientes del tratamiento agente anti-mitótico. Típicamente, aproximadamente 1.000 neuronas permanecen por pocillo en una placa de 96 pocillos.

* Problemas con la contaminación por hongos o bacterias se hacen evidentes en las primeras 24 horas de la cultura. Examine cuidadosamente cada pocillo para el crecimiento microbiano antes de la sustitución de los medios de comunicación de galvanoplastia. Si sólo un número limitado de pozos se ven afectados, pueden ser tratados con una solución de cloro diluido, se enjuagó con PBS y se secó a fin de proceder con el experimento. Se recomienda volver a realizar cualquier experimento en el que incluso un número limitado de pozos tenían la contaminación microbiana. Si la contaminación microbiana extensa se ​​observa en el plato 96, así, el experimento debe ser terminado.

2. La infección de SCG Cultomedidas de protección contra el VHS-1 US11-EGFP y establecimiento de la latencia

Para algunos datos útiles sobre las técnicas virológicas, incluyendo la propagación de virus básica, título de la determinación del virus, y la multiplicidad de infección (MOI), se remite al lector a la referencia 5. Para una discusión de la biología del herpesvirus, se remite al lector para hacer referencia a 6. Por último, se remite al lector a las referencias 7-10 para los ejemplos anteriores, los protocolos de otros, y de fondo sobre el tema del alfa-herpesvirus infección lítica de las neuronas SCG y para la comparación con las adaptaciones de nuestro protocolo para estudiar la latencia y reactivación.

  1. En DIV 6, añadir aciclovir (ACV), la concentración final de 100 mM de los medios de comunicación existentes en cada * así. Por ejemplo, si cada pocillo contiene 50 l, se añaden 25 l de un stock de 300 mM ACV. Típicamente, ACV se añade la noche antes de la infección, pero también se pueden añadir 6-8 horas antes de la infección.

* Se trata de exceedingly importante reducir al mínimo la manipulación innecesaria física de la neurona en todo momento. Basta con remover y reemplazar los medios de comunicación o de infectar a las reservas de virus debe hacerse con mucho cuidado y lentamente. De lo contrario, la tensión mecánica resultante puede afectar negativamente a la viabilidad neuronal.

  1. En DIV 7 de infectar a las culturas SCG con HSV-1 US11-EGFP (que se describe en la referencia 11) a una multiplicidad de infección (MOI) entre el 1 -2 (véase el comentario a continuación importante en la determinación de MOI óptimo) *. Añadir el virus diluido directamente a los medios de comunicación existentes en el pozo. Incluir un control de la maqueta infectada y un control de la infección lítica positiva en los medios de comunicación carecen de ACV. Permitir que la infección continúe durante 2-3 horas a 37 ° C.

* MOI se calcula utilizando título del virus determinó realizando un ensayo en placa en células Vero 12 y el número de células establecidas, vivos sembradas por pocillo en el paso 1,14. Este cálculo sólo es útil en un sentido operativo,como el número total de células sembradas contiene neuronas junto con glía contaminante, y fibroblastos. Como estas células contaminantes divisorias son destruidos por el tratamiento con agentes anti-mitótico, la eficaz MOI para las neuronas supervivientes es en realidad mayor. De la cantidad inicial a partir de 5.000 - 6.000 células vivas, alrededor de 1.000 neuronas permanecen después del tratamiento con agentes anti-mitótico (según lo evaluado por el recuento de células trypsinizing y directa). El óptimo MOI a utilizar cuando infectando cultivos neuronales pueden variar algo de un stock de virus preparación para el siguiente. Con cada nueva preparación de virus, recomendamos probar una gama limitada de diferentes MOI 1 a 2. El objetivo aquí es identificar el que tiene menos efectos sobre la viabilidad de las neuronas y los resultados en el mayor número de eventos de reactivación inducible (definido en la sección 3). El virus de la US11-EGFP es particularmente útil en la rápida optimización de las condiciones, pero también se pueden utilizar otras lecturas, como la placa de ensayo o de cuantificaciónsentante de PCR. Se puede ayudar a utilizar virus purificado a través de un colchón de sacarosa para eliminar las impurezas que reducen la viabilidad celular, aunque esto no es esencial y no se realizan rutinariamente.

  1. Vuelva a colocar cuidadosamente los medios de comunicación de infección con el nuevo modelo operativo nuevo que contenía 50 ng / ml de NGF y 100 mM * ACV.

* Es muy importante ser muy cuidadoso al cambiar los medios de comunicación de infección. Objetivo de la punta de la pipeta en la pared del pozo en vez de en la parte inferior del pozo, y permitir que los medios para deslizarse suavemente hacia abajo sobre las células. Incluso rápida expulsión de los medios de la pipeta puede generar suficiente fuerza para separar los axones del sustrato y hacer que las células desprenderse típicamente como una lámina de células. Si sólo un número limitado de neuronas de desconexión (20-30%), las consecuencias son mínimas, siempre que las células parecen sanos. Las neuronas individual es probable que vuelva a colocar en el tiempo, sin embargo, los axones ya no se extiende bien und nuevos axones volverá a crecer. Si bien no es óptima, el experimento puede proceder si sólo un número limitado de pozos se ven afectados. Si hay desprendimiento extensa de las neuronas (70-80%), no recomendamos incluyendo el pozo afectado (s) en el experimento. Si la mayoría de los pozos contienen 70-80% neuronas individual, se recomienda la terminación del experimento. Aunque las neuronas todavía puede vuelva a colocar, por lo general se forman grumos grandes. Esto complica la evaluación adecuada de las neuronas individuales reactivadas. Se recomienda volver a realizar cualquier experimento en el que los pozos con las neuronas aisladas fueron observados para asegurar que las tasas de reactivación no se vieron afectadas por la adhesión diferencial de las neuronas a los pozos.

Además, es crítico para manejar los cultivos siempre tan suavemente como posiblemente. La tensión mecánica de los movimientos innecesarios, bruscos (incluyendo la apertura y cierre repetidos de una puerta de la incubadora de la cámara) o fuerza de aplicaciones de medios ccompromiso Ould la capacidad de las culturas para apoyar el VHS-1 latencia, posiblemente resultando en tasas inaceptablemente altas de una reactivación espontánea en un experimento dado.

  1. Mantener los cultivos durante 6 días durante el cual el virus se establecen latencia. Durante este período, el uso de un microscopio fluorescente para vigilar la salud y la neurona expresión US11-EGFP como un indicador de la replicación lítico. US11-EGFP se detectó sólo en los pocillos de control que carecen de tratamiento de ACV, lo que indica una infección primaria con éxito y la replicación lítica productiva. Las neuronas pueden mostrar efectos citopáticos, incluso en ausencia de crecimiento viral productiva. Los cultivos infectados deben ser estrechamente vigilados y en comparación con el modelo de neuronas infectadas.

3. Reactivación y Evaluación

  1. En DIV 14, vuelva a colocar cuidadosamente los medios de comunicación que contienen ACV con medio fresco que carecen de ACV. En su caso, incluya farmacológicos (o biológicas) las variables en este momento. Sea sure seguir las precauciones indicadas en el punto 2.3.
  2. Durante un periodo de 5 a 6, monitorear los cultivos vivos utilizando un microscopio de fluorescencia para detectar las neuronas sometidas a la reactivación. Alternativamente recoger muestras para otros tipos de análisis (proteínas, ácidos nucleicos, etc placa de ensayo).
  3. Calcular la frecuencia reactivación contando el número de pocillos que contienen EGFP neuronas positivas y expresarlo como un porcentaje del número total de pocillos de muestra. Tenga en cuenta que la expresión de EGFP en un individuo así no distingue entre un evento de reactivación del principal y la posterior infección debido a la propagación viral. Desde propagación infecciosa está contenida en una sola cultura así, uno o más EGFP-positivas neuronas en un bien se define operacionalmente como un evento de reactivación un bajo estas condiciones.

* Múltiples eventos de reactivación puede ocurrir en una cultura, como se describe en 1. Para distinguir un evento de reactivación de primaria a partir de la propagación viral resultante de la reacción tivación, el inhibidor de la encapsidación WAY-150138 se puede añadir. Mediante el bloqueo de encapsidación, virus infeccioso no se produce y se extendió como resultado de la reactivación no es posible. Por lo tanto, la señal de EGFP detectado en la presencia de WAY-150138 refleja el número de eventos de reactivación independientes dentro de una cultura singe así 1,13-15. Tenga en cuenta que WAY-150138 sólo es eficaz contra el VHS-1 cepa Patton y no está disponible comercialmente. Como una alternativa a WAY-150138, considerar el uso de cualquiera de los siguientes: i) un virus mutante afectada en su capacidad de propagarse a las células vecinas pueden ser utilizados, ii) un virus reportero donde EGFP se expresa a partir de un promotor IE en la presencia continua de ACV, iii) tratamiento con PAA o ACV para evitar la expresión del gen tardío (y la producción de virus infeccioso) seguido por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos dirigidos contra un producto del gen IE.

4. Métodos alternativos para evaluar la reactivación utilizando el ensayo de

ONTENIDO "> Los resultados de un experimento individual, solo se debe obtener de una sola preparación de CGS. replicar experimentos se puede realizar con preparaciones SCG independientes, siempre y cuando cada réplica se realizó utilizando un lote SCG clave.

  1. Evaluación de HSV-1 transcripciones líticas. Recoger ARN en momentos deseados después de la eliminación del ACV en la presencia o ausencia de diferentes inductores experimentales de reactivación. Cuando se utilizan 96 placas de cultivo, así, se recomienda la puesta en común de al menos 20 pozos en conjunto para cada muestra (aproximadamente 10 5 células por muestra de ARN). Alternativamente, se puede SCG chapada en grandes pozos (por ejemplo, para una placa de 24 pocillos, utilice 4-5 x10 4 células / pocillo). Aunque ciertamente es posible detectar ARN de menos de 20 pozos, los volúmenes de resultados pequeños participan en la muestra injustificada a la muestra de la variabilidad.
  2. La detección de HSV-1 proteínas líticas. Recoger lisados ​​en un tiempo deseado después de la inducción de la reactivación. Añadir 7,5 l de tampón de lisis a cada una de 10 Wanas en una placa de 96 pocillos y analizar por SDS-PAGE e inmunoblot. Alternativamente, las proteínas virales pueden ser detectados por microscopía de inmunofluorescencia indirecta. El recubrimiento inicial debe hacerse sobre un sustrato montable para formación de imágenes tales como un cubreobjetos de vidrio estéril que ha sido pre-recubiertas con poli-D-lisina (0,2 mg / ml, Sigma) antes de la aplicación de colágeno y laminina (ver 1,10) .
  3. La detección de partículas infecciosas. Recoger sobrenadante del cultivo sobre la reactivación. Realizar un ensayo en placa en monocapas de células Vero utilizando diluciones seriadas del sobrenadante. Además, los ensayos de placa se puede realizar utilizando lisados ​​de congelación-descongelados cultivos para incluir células asociadas a las partículas para determinar título.

5. Los resultados representativos

La figura 2A ilustra un ejemplo en el que 1 mM tricostatina A (TSA), un inductor conocido de reactivación 16-18, se aplica al CGS cultivos infectados de forma latente con el H de tipo salvajeSV1 EGFP-US11 reportero de la cepa. Con la TSA, la reactivación alcanza el 50% del máximo dentro de 2 días, y por 5 días las mesetas reactivación en torno al 60% de los pocillos. Línea de base ("espontánea") la reactivación es de aproximadamente 10% en este experimento y por lo general oscila entre el 10-20% utilizando este sistema in vitro. Los niveles máximos de reactivación variar dependiendo de qué inductor reactivación se utiliza. Muchos inductores reactivación puede ser aplicado para la duración del experimento, ya que no interfieren con la replicación viral productiva, pero esto se debe determinar empíricamente. Otros inductores, incluyendo cualquier reactivo que afecta a la viabilidad de las neuronas u obstaculiza la finalización del ciclo de vida productiva viral, puede requerir una aplicación impulso transitorio para provocar la reactivación.

Mientras que la acumulación de EGFP-US11 en cada pocillo del experimento representado en la Figura 2A es indicativa de reactivación de la latencia, no distingue si elUS11-EGFP señal en las neuronas individuales se deriva de un evento reactivación independiente, o la propagación de un virus reactivado a través del cultivo. Para evaluar el número de neuronas sometidas a eventos independientes de reactivación en cada pozo, los cultivos fueron pre-tratados con WAY-150138, un compuesto que bloquea específicamente la propagación del virus evitando encapsidación del ADN viral del genoma 13-15. Cultivos de neuronas simpáticas infectados fueron tratados con WAY-150138 y la reactivación inducida con TSA. Un número significativo de EGFP-positivas las neuronas sólo se detectaron en los pozos de la TSA tratados, en comparación con los cultivos de control tratados con DMSO, lo que demuestra que una serie de eventos de reactivación independientes se producen por la cultura individual (Figura 2B).

En nuestro ensayo, el periodista US11-EGFP se expresa desde el promotor endógeno de US11 11. Desde US11 es un "verdadero-finales" o γ 2 genes lítico viral, la replicación del ADN viral es necesaria para la robusta expressisucesivamente. Esto se ilustra en la Figura 3, como EGFP-US11 acumulación se ve perjudicada por la polimerasa viral ADN ácido fosfonoacético inhibidor (PAA) en cultivos inducidos de reactivar con el inhibidor LY294002 PI3-quinasa.

Figura 1
Figura 1. Esquemático que ilustra un protocolo típico experimental utilizando la neurona cultivadas sistema in vitro para estudiar el VHS-1 latencia y reactivación. 1) Después de la disección de ganglios cervical superior (SCG) de ratas E21, las neuronas disociadas se sembraron en 96 pocillos y se trató con anti-mitótico agentes para eliminar las células no neuronales. 2) Después de 6 días in vitro (DIV), los cultivos se infectaron con HSV-1 recombinante que contiene EGFP fusionada a la codificada por el virus US11 gen tardío (EGFP-VHS-1) en presencia aciclovir (ACV), un fármaco antiviral que bloques de replicación lítico. 3) el día 14 (DIV 14), el aciclovir se elimina y la expresión de EGFP-no se detecta. Los cultivos pueden ser mantenido de forma estable de esta manera durante 1 mes o más, o una variable de prueba se puede añadir a evaluar su capacidad para provocar la reactivación de la latencia. La variable puede estar en la forma de un inhibidor químico de la molécula pequeña, un anticuerpo contra una neurotrofina soluble o proteína de superficie celular, o un lentivirus que manifieste una ARNhc gen específico o una proteína expresada ectópica. Reactivación A continuación se monitoriza por anotar EGFP-positivas pozos en tiempo real.

Figura 2
Figura 2. TSA se reactiva el VHS-1 en cultivos de CGS. Culturas SCG fueron infectados de forma latente, como se describe en la Figura 1. En DIV 14 de ACV fue eliminado y reemplazado con los medios de comunicación que contiene 1 mM tricostatina A. (TSA) (A) Los cultivos se visualizó y obtuvo mediante microscopía de fluorescencia cada día después del tratamiento de drogas durante un período de 5 días. El porcentaje de pozos sometidos reactivationes en el transcurso del experimento se muestran en comparación con el control DMSO cultivos tratados. Porcentaje de reactivación se calculó por el número de EGFP-positivas pozos de los 20 pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos. Las barras de error indican el error estándar de la media. (B) los cultivos de infección latente fueron tratados con TSA y un inhibidor de encapsidación del ADN viral, WAY-150138 (20 mg / ml). El número de EGFP + neuronas se comparó 48 horas después del tratamiento con los medicamentos para el control tratado con DMSO y MANERA 150.138. Cada punto de datos representa la relación de EGFP + neuronas fuera de 1.000 neuronas en un cultivo así. Barra muestra el porcentaje promedio de EGFP + neuronas en un pozo.

Figura 3
Figura 3. Detecion EGFP depende de la replicación del ADN vírico. Culturas SCG fueron infectados de forma latente luego se trató con 10 mM de LY29004, un inductor conocido de reactivación 1. La reactivación inducida por LY (azul) was en comparación con aquellos tratados con un inhibidor de la síntesis del ADN viral, ácido phophonoacetic, PAA (300μg/ml, rojo) y los dos compuestos juntos (verde).

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Discussion

Esta cultura de la neurona y el sistema de la infección primaria proporciona un método simple y eficaz para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a HSV-1 de latencia y reactivación. El sistema fielmente recapitula los punzones aceptados de latencia definidos, tanto en infecciones humanas y en modelos de animales vivos. Cuando el virus está latente en los cultivos SCG, las partículas virales infecciosas y productos génicos líticas no puede ser detectada. El único producto del gen viral detectado en las neuronas latentemente infectadas es la transcripción no codificante LAT, que se acumula dentro de los núcleos. La reactivación coincide con la expresión de los genes virales líticas y culmina en la producción de partículas infecciosas. Por otra parte, esta célula primaria de la neurona modelo de cultivo es sensible a los inductores de reactivación aceptados, tales como la TSA, lo que efectivamente induce la replicación viral lítico.

Inductores químicos diferentes estimular la reactivación en diversos grados y con características cinéticas. Por ejemplo, la TSA induce la reactivación reproducible en el 60-70% de los cultivos durante un período de observación de 5 d. Niveles similares de la TSA inducida por la reactivación se han reportado con latentemente infectadas, feocromocitoma de rata PC12 diferenciadas las células murinas 17 o cultivos de neuronas del trigémino 18. La cinética de la reactivación se observa y la incapacidad de TSA para reactivar 100% de los cultivos podrían reflejar la heterogeneidad en la capacidad de los genomas latentes que se desreprimidas. De acuerdo con esta propuesta, la eficacia de TSA inducida reactivación informa disminuye como una función del tiempo en cultivo 18. En contraste con la TSA, LY29004 induce la reactivación en el 80-90% de los cultivos dentro de 2-3 días. Las diferencias en el establecimiento de latencia o momento de inercia no es probable que teniendo en cuenta las diferencias en la reactivación inducida entre TSA y LY29004, ya que nuestras condiciones para el establecimiento de la latencia reproducible resultar en aproximadamente el 20% de las neuronas que expresan el culo latencia codificada por el virustranscripción ociated LAT 1. Sin embargo, todavía no hemos medido la fracción de virales positivos genoma de células, aumentando la posibilidad de que LY29004 induce la reactivación en un mayor número de neuronas que TSA. Si bien las razones que subyacen a la capacidad diferencial de la TSA y LY20004 para inducir la reactivación no se habían determinado, es evidente diferentes agentes inductores pueden promover la reactivación con la eficiencia característicos y la cinética.

Un aspecto de gran alcance del sistema es la capacidad de utilizar cepas de virus de tipo salvaje o reportero que se comportan indistintamente de un virus de tipo salvaje. A diferencia de anteriores sistemas de cultivos celulares para el estudio de HSV-1 latente, que se basó en las variantes mutantes de VHS que eran incapaces de reproducir de manera productiva 16,18,19, revisado en el 20, nuestro sistema modelo incorpora una cepa EGFP-periodista que es indistinguible de la de tipo salvaje virus en términos de eficacia de la replicación lítica en células cultivadas 11. El uso de una v EGFP reporteroirus permite una evaluación visual sensible y directa de latencia y reactivación. En contraste con otros reporteros tales como β-galactosidasa, que requiere la fijación y la lisis de las células para el análisis, EGFP permite al investigador para supervisar el estado viral a lo largo de todo el curso de un experimento, proporcionando una fácil, en tiempo real de evaluación de espontánea e inducida reactivación. Otros métodos, como la PCR cuantitativa, se puede utilizar también para mirar virales patrones de expresión génica que preceden EGFP-expresión, ya EGFP se expresa como un "verdadero-tarde" gen, o de cepas de virus que carecen de un gen reportero. Por otra parte, otros virus reportero, donde se fusiona con EGFP inmediatos tempranos (IE) o temprano (E) los genes se podrían desarrollar. Una ventaja de usar la "verdadera-tarde" EGFP-reportero descrito es que EGFP-expresión es estrictamente dependiente de la síntesis del ADN vírico, lo que indica que el ciclo de vida del virus se ha procedido a la fase de la expresión génica final asociado con el crecimiento lítico. Indeed, "verdadero-tarde" EGFP expresión a niveles detectables por inspección visual se correlaciona bien con la producción de virus infeccioso, un indicador biológico que la reactivación productiva se ha producido. Sin embargo, queda por ver si cada neurona que comienza la reactivación, medida por ciclo productivo (lítico) la expresión del gen, es capaz de avanzar a través del programa completo lítico para producir virus infeccioso. Tal vez los virus tienen una amplia oportunidad de abortar el programa lítico y restablecer la latencia. Por lo tanto, los virus que expresan EGFP reportero fusionado con IE o E proteínas puede dar lugar a lecturas de reactivación menos fiables. Desde esta perspectiva, la comparación de la eficiencia de la reactivación midió utilizando EGFP-periodistas expresadas por el IE, E, o los promotores finales, o incluso un reportero combinado con diferentes proteínas fluorescentes reportero fusionadas a un producto génico de cada clase de energía cinética (E vs IE vs ) tarde sería útil. Además, nuestro sistema neuronal cultivo celular también puede utilizarse con diferentes VHS-1 ªlas lluvias, independientemente de su potencial neuroinvasiva o la capacidad de regular la respuesta inmune del huésped 21-24. Finalmente, el sistema de cultivo in vitro descrito aquí se puede aplicar a otros tipos de células neuronales in vivo y ex culturas periféricas ganglios obtenidos a partir de especies de orden superior, incluyendo seres humanos 25-27.

Mediante el uso de una población pura de las neuronas, los estudios detallados de las interacciones entre HSV1 y su anfitrión neuronal a nivel molecular son ahora posibles. Cabe destacar que este modelo de sistema evita los numerosos y complejos problemas asociados a la latencia y reactivación, en el estudio de los animales inmunocompetentes, donde los niveles adicionales de control se colocan en capas en la parte superior de la neurona fundamentales interacciones virus-. Además, el trabajo en este sistema demuestra claramente que no es de hecho una relación estable entre el virus y las neuronas de host que pueden crearse y mantenerse sin la ayuda de una respuesta inmune adquirida. Si bien innato y ADAPTIVla inmunidad e claramente juegan un papel importante en la biología de infecciones latentes de HSV, el virus tiene la capacidad intrínseca i) para establecer una infección no productiva se asemeja a la latencia en las neuronas, y ii) para cambiar a un programa de lítica, la replicación productiva en respuesta a la del medio ambiente y las señales neuronales aplicadas a las neuronas por sí solos. Es importante destacar que la base molecular de esta relación única entre el VHS y la neurona ya se puede disecar el uso de células biológicas, el silenciamiento farmacológico, gen, y las herramientas de administración de genes 1. Los estudios de este tipo que se centran en la neurona y el virus de forma aislada, no es posible en modelos animales en los varios tipos de células ocupan el compartimiento ganglionar. Esperamos que mediante el uso de este modelo de sistema, una comprensión completa de los circuitos moleculares complejos que regula el HSV-1 latente en las neuronas, finalmente se puede lograr. Siempre que sea posible, los principios recogidos en este sistema de neuronas cultivadas se puede probar in vivo usando animales establecida mesesdels, que ilustran la naturaleza complementaria de estos dos enfoques para el estudio global de HSV-1 latente.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Agradecemos a los revisores por sus sugerencias reflexivas que ayudaron a mejorar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas a MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) y la mensajería instantánea (AI073898, GM056927) de los NIH. MK fue apoyado en parte por una subvención del NIH formación (5T32 AI007180).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

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References

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