Protokollet beskriver en effektiv och reproducerbar modell för att studera herpes simplex-virus typ 1 (HSV-1) latens och reaktivering. Analysen använder homogena sympatiska neuron kulturer och möjliggör den molekylära dissektion av virus-neuron interaktioner med hjälp av olika verktyg, bland annat RNA-interferens och uttryck av rekombinanta proteiner.
Herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) upprättar ett livslångt latent infektion i perifera nervceller. Denna latenta reservoar är källan till återkommande reaktivering händelser som garanterar överföring och bidra till klinisk sjukdom. Nuvarande antivirala inte påverkar inte den latenta reservoaren och det finns inga vacciner. Medan de molekylära detaljerna i lytisk replikering är väl kännetecknas mekanismer som styr latency i nervceller kvar svårfångade. Vår nuvarande förståelse av latens är härledd från in vivo-studier med användning av små djurmodeller, vilka har blivit oundgängliga för att definiera virala genprodukter krav och rollen av immunsvar. Det är emellertid omöjligt att särskilja specifika effekter på virus-neuronen förhållande från mer generella konsekvenserna av infektion som medieras av immun-eller icke-neuronala stödceller i levande djur. Dessutom är djurförsök kostsamt, tidskrävande och begränsade i form av tillgängliga alternativ för att manipulera värdenprocesser. För att övervinna dessa begränsningar, är en neuron-system med enbart ett desperat behov av att återger in vivo egenskaper latens och reaktivering men erbjuder fördelarna med vävnadsodling i termer av homogenitet och tillgänglighet.
Här presenterar vi ett in vitro-modell att använda odlade primära sympatiska nervceller från råtta överlägsna cervikala ganglier (SCG) (Figur 1) för att studera HSV-1 latens och reaktivering som passar de flesta om inte alla önskade kriterier. Efter eliminering icke-neuronala celler, är nästan homogena TrkA + neuron kulturer infekterades med HSV-1 i närvaro av acyklovir (ACV) för att undertrycka lytisk replikation. Efter ACV bort, icke-produktiva HSV-1 infektioner som troget uppvisar accepterade kännetecken latens effektivt etablerade. Noterbart lytiska mRNA, proteiner och infektiöst virus blir odetekterbar, även i frånvaro av selektion, men latens-associerad transkript (LAT) uttryckerion kvarstår i neuronal kärnor. Virala genom hålls vid en genomsnittlig kopietal av 25 per neuron och kan induceras att produktivt replikera genom att interferera med PI3-kinas / Akt-signalering eller den enkla tillbakadragande av nervtillväxtfaktor 1. En rekombinant HSV-1 kodning EGFP smält till det virala lytiska proteinet US11 ger en funktionell, real-time markör för replikering till följd av reaktivering som lätt kvantifieras. Förutom kemiska behandlingar kan genetiska metoder såsom RNA-interferens eller gentillförsel via lentivirala vektorer med framgång tillämpas på systemet som medger mekanistiska studier som är mycket svåra, om inte omöjligt, i djur. Sammanfattningsvis ger SCG-baserade HSV-1 latens / reaktivering systemet ett kraftfullt, nödvändigt verktyg för att reda ut de molekylära mekanismer som styr hsv1 latens och reaktivering i nervceller, en lång stående pussel i virologi vars lösning kan erbjuda nya insikter för att utveckla nya terapier som Målet tHan latent herpesvirus reservoar.
Denna primära neuron kultur och infektion system ger en enkel och effektiv metod för att utforska de molekylära mekanismerna bakom HSV-1 latens och reaktivering. Systemet sammanfattas troget de accepterade kännetecken latens som anges i både mänskliga infektioner och i live-djurmodeller. När viruset latent i SCG kulturer, kan smittsamma partiklar och virala lytiska genprodukter inte detekteras. Den enda virala genprodukten detekteras i latent infekterade neuroner är den icke-kodande LAT-transkri…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar granskarna för deras genomtänkta förslag som bidragit till att förbättra detta manuskript. Detta arbete har finansierats med bidrag till MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) och IM (AI073898, GM056927) från NIH. MK stöddes delvis av en NIH utbildningsstipendium (5T32 AI007180).
Reagent | Company | Catalog# | Comments |
70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |