Summary
여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
생분해성 nanoparticles는 호흡기 감염증에 대한 새로운 비강 백신의 설계 및 구현을위한 다목적 플랫폼으로 등장했습니다. 특히, polyanhydride는 지방족 sebacic 산성 (SA), 방향족 1,6 - 비스 (파라 - carboxyphenoxy) 헥산 (CPH) 또는 amphiphilic 1,8 - 비스 (파라 - carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane 구성되어 nanoparticles (CPTEG) 독특한 벌크 및 표면 부식 속도론 1,2을 표시하고 천천히 생체내 3,4,5의 기능 biomolecules (예, 단백질 항원, 면역 글로불린 등) 출시될 악용될 수 있습니다. 이러한 그들 백신 전달 플랫폼 6,7,8을위한 탁월한 선택하고, 또한 소유 내장 도움이되는 활동 nanoparticles.
비강 점막 접종에 따라 타고난 면역의 활성화를 지배하는 메커니즘을 명료하게하다하기 위해, 하나는 항원 P의 분자 및 세포 반응을 평가한다면역 반응을 시작 책임을 원망 세포 (APCs). 폐포 macrophages는 (AMɸ) 폐 실질 조직 9,10,11에 predominate 동안 돌기 세포는기도를 실시 발견 교장 APCs 있습니다. AMɸ 미생물 병원균과 세포 잔해 12,13의 폐를 청소에 매우 효율적입니다. 또한이 세포 유형은 적응 면역 반응 9 개시에 중요한 첫 걸음이다 배수 림프절에 미생물 항원의 수송에 중요한 역할을한다. AMɸ 또한 타고난 패턴 인식 및 청소 수용체, 분비 프로 염증 중재자, 및 주요 나이브 T 세포 12,14의 높은 수준을 표현. AMɸ (예,보다 큰 80 %)의 비교적 순수한 인구는 쉽게 연구실에서 공부를 위해 폐 세척을 통해 얻을 수있다. AMɸ 면역 능력이 동물로부터 수확 거주 encounte됩니다 macrophages의 대표적인 표현형를 제공합니다생체내의 R은 입자 기반의 백신. 여기, 우리는 생쥐에서 수확과 문화 AMɸ에 사용되는 프로토콜을 설명하고 체외에서 polyanhydride의 nanoparticles와 치료에 따라 macrophages의 활성화 표현형 검사합니다.
Protocol
1. 폐 세척을 사용하여 마우스에서 폐포 Macrophages을 (AMɸ) 수확
- 이러한 실험 복, 일회용 장갑, 적절한 눈 보호 등 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.
- 수확 개시 전에 전체 AMɸ (cAMɸ) 매체를 준비합니다. 페니실린 / 스트렙토 마이신 Dulbelcco의 수정일 독수리 중간 (DMEM)의 222.25 ML에 (펜 / strep) 솔루션, β-메르 캅 토 에탄올 250 μL (2 - 메르 캅 토 에탄올) 및 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)의 25 ML 2.5 ML을 추가합니다. 진공 하에서 0.2 μm의 기공 크기의 병 최고의 필터를 사용 cAMɸ 매체를 필터 - 소독.
- euthanization 챔버의 CO 2 질식하여 건강한 마우스를 안락사. C57BL / 6 마우스 (6-8주 오래된)는이 프로젝트의 목적으로 사용되었지만,이 폐 세척 기술은 마우스의 어떤 변형을 수행할 수 있습니다. 압축 가스 실린더를 사용하여 채널에 마우스를 배치하기 전에 1 분 동안 챔버로 가스 흘러가게챔버가 완전히 CO 2로 기소되어 있는지 확신하기 위해 호박. 마우스를 안락사시키려는 적어도 한 분만 챔버에서 마우스를 놓으십시오. 또한, 1.4에서 설명한대로 마우스 사망을 확인하는 물리적인 방법으로 심장 주사를 통해 각 마우스를 ...에게서 피를 뽑다.
- 그 뒤로 (지느러미 쪽), 70 % 에탄올로 스프레이에 마우스를 쌓고, 흉골을 찾아, 복부에서 30도 각도로, 흉강으로 50mm에 대해 23 게이지 바늘 (1 ML의 주사기에 부착된)를 삽입 . 바늘의 적절한 배치와 함께, 그것은 마우스의 크기에 따라 혈액의 1-0.4 사이 ML를 수집할 수 있어야한다. 생체 신호의 정지를위한 동물을 검사합니다.
- 그것이 그 복부 (복부 측면)에 거짓말을하고 있도록 실험실 벤치에서 플레이스 마우스. 작업 환경을 소독하기 위해 70 %의 에탄올과 스프레이 마우스. 거의 반쯤 마우스 척추 아래 피부를 꼬집어. 70 % 에탄올로 소독되어 해부 가위를 사용하여 피부를 통해 작은 절개를합니다. </ 리>
- 절개의 양쪽 피부를 잡고 마우스 두개골 - 꼬리 축을 따라 반대 방향으로 피부를 당기십시오. 제대로하면 피부가 기본 시체에서 제거됩니다.
- 마우스의 목은 이제 노출된 근육과 땀샘을 표시해야합니다. 그거 조심해서 조직을 잘라내어함으로써 마우스 후두, 기관 및 식도를 노출, 집게를 사용하여 마우스의 앞부분으로 그것을 당기십시오. 경정맥 정맥 또는 경동맥을 절단하지 마십시오.
- 호흡 관은 이제 볼 수 있으며 주변의 연골 고리와 조직 등 식별할 수있다. 정교한 포셉 함께 호흡 관을 보유하고 부드럽게 리프트와 지느러미 측면에있는 식도에서 호흡 관을 분리.
- 하나가기도하지만, 후두의 뒷부분을 보유한 곳으로 작은 절개의 앞부분을 만듭니다. 절개는 약 45 ° 정도의 각도로하여야한다. 또한, 완전히 이것으로 retracting에서 차단하므로 호흡 관을 가로로 쪼개다 없습니다바디 캐비티.
- 기도의 루멘에 카테터를 삽입하기 위해 준비 멸균 PBS와 톰 고양이 카테터를 들으며 한 CC의 주사기를 채우십시오. 집게를 사용하여기도를 잡고 손으로 통제를 증가시키고 부드럽게 tracheal 절개 사이트에 삽입하기 위해 가까운 끝에 카테터를 개최. 부드럽게 20mm에 대해 기관에 카테터를 삽입합니다. 다른 손을 자유롭게, 카테터 튜브 주위 기관 잡아.
- 카테터를 들으며 1 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 폐로 실내 온도, 멸균 PBS의 0.75 ML을 불어 넣다 후 부드럽게 PBS에 다시 주사기로를 기음. 외부 가슴을 마사지하는 동안이 과정을 세 번 반복합니다. 카테터에서 주사기를 분리하고 15 ML의 원심 관에 세척 유체 분배. 신선한 PBS의 0.75 ML로 주사기를 작성하고 카테터에 주사기를 다시 연결 후, 각각의 마우스에 대해 두 번 단계 1.9 1.10를 반복합니다. 유체 복구 덜 조종 이상을 획득, 부분 수lume는 풍의. 하나 이상의 마우스 세포를 수집하는 경우 모든 폐 lavages이 수행될 때까지, 얼음에 수확 세포와 함께 15 ML 튜브를 넣습니다.
2. 폐 세척 AMɸ 수확 가공
- 4에 10 분 ° C. 250 X g에서 폐 세척 액체를 원심 분리기
- biosafety 캐비닛 내부의 적절한 폐기물 용기에 무균 기술, 가만히 따르다 뜨는 사용하기. 부드럽게 테스트 튜브 랙 상단에 걸쳐 원심 튜브를 긁어하여 세포 펠렛을 Resuspend. 세포를 resuspend하는 cAMɸ 매체의 1 ML을 추가합니다.
- 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터 유리병에 Isoton II 희석제의 10 ML로 세포의 20 μL를 pipetting하여 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 입자 카운터 Z1을 사용하여 세포를 열거합니다. , 유리병으로 보내겠-oglobin II lytic 시약을 3-4 방울을 추가 부드럽게 반전 3-4 회 후 세포 농도를 얻기 위해 카운터로 샘플 병을로드합니다. 를 표시하는 2 × 10 4 희석 요인으로 카운터를 프로그래밍하십시오ML 당 세포의 숫자와 같은 세포 농도.
- cAMɸ 매체를 사용하는 ML 당 2.5 × 10 5 세포를 희석.
- 6 잘 조직 문화 요리의 각도에 2.5 × 10 5 세포 / ML 2 ML 하는걸.
- 세포가 잘 하단을 준수하도록 6 H에 대한 5 % CO 2 분위기로 37 ° C humidified 인큐베이터 안에서 AMɸ, 품어 문화 요리 풍성합니다. 부드럽게 점착 성의 세포를 방해하지 않도록로 뜨는을 기음.
- 비 점착 성의 세포 파편을 제거하는 무균 PBS를 (칼슘과 무료 마그네슘)를 사용하여 우물을 씻어. 각도에 cAMɸ 중간 2 ML을 추가합니다.
- 각성제의 또한 이전에 5 % CO 2 분위기 37 ° C humidified 인큐베이터 안에서 하룻밤 세포를 품어. 이 농축 단계 후, 세포의 약 87%는 대식 세포 마커 CD11b 및 F4/80 (그림 2C)에 대한 긍정적입니다.
3. Polyanhydrid의 추가전자 Nanoparticles 및 제어 트리 트먼트
- polyanhydride 안티 솔벤트 nanoencapsulation 15를 통해 nanoparticles를 조작. 이 과정에서는 폴리머는 메틸렌 클로라이드에 녹아있다 (4 ° C에서 25 밀리그램 / ML의 농도에서)과 pentane (1:200 비율로 메틸렌 클로라이드에서 -20 ° C : pentane)에 시켰던.
- 소독을 정확하게 마이크로 그램 금액을 측정할 수있는 균형에 종이를 무게를 사용하여 polyanhydride의 nanoparticles을 달다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 입자를 추가합니다.
- 얼음 추위 cAMɸ의 nanoparticles을 Resuspend. 계산은 매체의 더 이상은 0.3 이상의 ML은 nanoparticles의 원하는 농도를 얻기 위해 각도에 추가됩니다 있도록 만들어집니다. nanoparticles 잘 문화에 추가됩니다 때까지 얼음 resuspended 입자를 유지.
- 이전 AMɸ 문화 nanoparticles를 추가하기 microtip으로 벤치 최고의 sonicator를 사용하여 입자를 sonicate. 70 % 에탄올과 wipin으로 분사하여 microtip 멸균을sonication 이전 멸균 Kimwipe과 g. 얼음 튜브를 유지하면서 30-45 s에 대한 10-20 쥴로에 Sonicate. macroscopically nanoparticle 현탁액을 관찰. 입자가 충분히 분산되지 않으면 정지가 nanoparticles은 30-45 초 동안 다시 sonicating 전에 폴리머의 유리 전이 온도 이하 있도록 데는 1-2 분 동안 얼음을 설정할 수 있습니다. 이 sonication 단계의 목적은 충분히 50:50 CPTEG으로 nanoparticles를 분산하는 것입니다 : 수성 환경에 노출되면 CPH nanoparticles는 누계로 경향이 있습니다. 그러나, nanoparticles의 작은 집계는 아직 정학에 남아있을 수 있습니다.
- Nanoparticle 서스펜션은 (적절히 분산) 얼음에 보관해야하며 조기 표면 침식이나 집합을 방지하기 위해 즉시 사용되지도 않습니다.
- 인큐베이터에서 AMɸ과 biosafety 캐비닛의 장소를 포함하는 문화 요리를 제거합니다. 메디의 양이 떨어져 약 45도 각도와 피펫의 틸트 플레이트어 그는 nanoparticle 현탁액 (이것은 0.3 ML을 초과해서는 안)에 추가됩니다. 매체를 제거하면 자기편 세포를 방해하지 마십시오.
- 와동 전에 적절한 우물에 추가로 간략히 polyanhydride의 nanoparticle 현탁액. 특정 잘 (들)로 nanoparticle 현탁액 (더 이상은 0.3 이상 ML)의 양을 피펫 있지만, 최대 피펫하지 않으며 다운 믹스합니다. 이 작업은 우물에서 AMɸ 자기편를 분리 수 있습니다. 입자는 잘 하단에 정착하고 세포를 연락 드리겠습니다. 이 보고서에 제시된 연구 내용 nanoparticles의 최종 농도 AMɸ와 공동 배양해 125 μg / ML했습니다. 후속 우물과 원하는 치료 그룹을 진행합니다. 이러한 매체에만 200 NG / ML lipopolysaccharide (LPS) 지정된 우물에 대해서 긍정적이고 부정적인 컨트롤 그룹을 포함합니다.
- 37에 문화 요리를 반환 ° C 48 H에 대한 5 % CO 2 분위기 humidified 인큐베이터. 우리 laborator의 운동 연구Y는 전사하고 발생하는 단백질 합성을 위해 충분한 시간을 허용으로 셀 표면 마커의 표현과 시토킨 분비를 모두 평가를위한 최적의 문화 시대로 48 시간 증명하고있다. 크린 시토킨보다 수준이 확장된 문화 기간 (즉, 72 시간) 동안 축적하지만이 시점에서 세포 표면 마커 표현을 평가할은 크린 시토킨의 상승된 수준의 기여에 의해 실마리를 못찾고 수 있습니다. 표면 마커 표현의 변화 nanoparticles 자체로 자극에 직접적으로 기인하지 않을 수 있습니다 관찰했다.
4. 유동세포계측법를 사용 AMɸ 활성화 평가
- 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 버퍼 (0.1 %의 나트륨 azide와 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 0.1에서 M 인산 이전 nanoparticles O와 공동 배양해 왔습니다 도금 macrophages 수확에 (산도 7.4) 염분 버퍼를 준비합니다R의 각성제.
- 차단 버퍼와 단클론 항체의 솔루션을 작동 준비합니다. 블록 버퍼를 준비하려면, FACS 버퍼에 각각 쥐 IgG (시그마)과 anti-CD16/32 (eBioscience) 1 밀리그램 / ML 및 10 μg / ML을 희석. 제조 업체가 권장 농도 또는 사용자에게 최적화된 농도 중 하나에 FACS 버퍼의 표면 마커 항체 패널을 희석. 이 작품에서 제시된 결과를 얻으려면 표면 마커 패널 MHC II, CD86, CD40 및 CIRE (CD209)에 대한 항체로 구성되어 있습니다. 대식 세포 마커 F4/80 및 CD11b에 대한 안티 - 마우스 항체는 또한 긍정적으로 데이터 분석 중에 대식 세포 표현형을 확인하기 위해 패널에 포함되어 있습니다. 근친 마우스 종자 종종 자신의 MHC II의 haplotypes에 차이로 MHC II 분자에 대한 항체를 선택할 때주의해야합니다. 선택된 항체가 관심 마우스 변형에 의해 표현된 특정 MHC alloantigens으로 반응해야합니다.
- 48 nanoparticles와 인큐베이션의 H 및 / 또는 후각성제, 20 분 얼음에 적절한 세포 배양 요리. 접시에서 자기편 macrophages를 제거하려면 부드럽게 24cm 셀 스크레이퍼로 우물을 다쳤어요.
- 5 ML serological 피펫을 사용하여 부드럽게 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 다섯 번이나 다운 세포와 매체를 대기음합니다. 별도 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 각각 우물의 내용을 피펫 그래서 등 다양한 실험적 치료에서 세포를 함께 섞어 없습니다.
- 각 튜브에 FACS 버퍼 2 ML을 추가합니다.
- 10 분 동안 4 ° C에서 250 X g에서 세포의 튜브를 원심 분리기.
- 가만히 따르다 테스트 튜브 랙 상단을 가로질러 튜브를 긁어하여 잔류 유체의 표면에 뜨는 부드럽게 resuspend 세포 펠릿.
- 단클론 항체의 비 특정 바인딩을 방지하기 위해서는 세포의 각각의 튜브에 차단 버퍼 10 μL를 (4.2 년 대비) 추가합니다. 와동 튜브 30 분 얼음에 품어.
- 각각의 튜브와 incub로 희석된 단클론 항체의 적절한 볼륨을 추가15 분 동강에 어둠 속에서 먹었습니다. 분석하는 시료를 포함 튜브 polycromatic 패널 (이전 항체의 조합 최적화 개별 연구소에 의해 수행되어야한다)의 항체의 조합을 수신해야합니다. 추가 제어 그룹이 올바르게 각각 단일 색상을 사용하여 레이블 셀에 해당 분류되지 않은 세포의 튜브를 포함 흐름 cytometer에 인수 매개 변수, 그리고 보상 튜브를 설정하는 데 포함되어야합니다. 제대로 흐름 cytometric 분석을위한 게이트를 설정하려면 형광 빼기 1은 (FMO) 컨트롤은 인수시 포함되어야합니다. FMO 컨트롤은 각 isotype 컨트롤로 대체됩니다 제외한 패널에 사용되는 모든 fluorochrome-복합 항체로 분류 세포입니다. 긍정과 부정적인 인구 (즉, 혼자 긍정적인 제어 흥분제와 매체로 치료 세포의 별도 aliquots)도 FMO 및 보상 제어 튜브에 포함되어야한다.
- 테스트 튜브 랙 상단을 가로질러 튜브를 긁어하여 잔여 액에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 세포 펠릿.
- 항체 패널 fluorochrome에 직접 복합없는 항체로 구성되어 있지만 비오틴 대신 복합 경우 fluorochrome - 복합 streptavidin은 표면 마커를 시각화하는 데 필요합니다. 이 단계에서 희석 fluorochrome-복합 streptavidin의 적절한 볼륨을 추가하고 얼음에서 15 분 동안 짙은 어둠 속에서 알을 품다. 4.2에서와 마찬가지로, streptavidin은 제조 업체에서 권장하는 농도 또는 사용자에 의해 최적화된 하나 희석됩니다. 이 단계는 biotinylated 일차 항체를 포함하는 패널이 필요합니다.
- 같은 4.10에서 설명한 세차 단계를 수행합니다.
- BD는 탈이온수에서 정착액 1시 3분을 안정화의 적절한 볼륨을 희석. 각각의 튜브로 희석 정착액의 100 μL를 추가 부드럽게 조종하는 동안세포 clumping 방지하기 rtexing. 라벨 및 고정 세포는 안정적으로 ° C 유동 cytometer에 인수 이전 약 1 주일 동안 4에 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
5. 대표 데이터
단계 3.1 가공 Nanoparticles은 163의 평균 직경이 ± 24 nm의 이전의 연구 5,16에서 구한와 일치하는 형태했다. 이전 sonication과 이후 솔루션 Nanoparticles은 입자의 적절한 분산을 보장하기 위해 sonication의 필요성을 입증하기 위해 그림 1에 표시됩니다. 폐 세척을 통해 얻은 수확 AMɸs의 흐름 cytometric 분석은 그림 2에 표시됩니다. 안티 마우스 CD11b 및 안티 마우스 F4/80 항체뿐만 아니라 해당 FMO 컨트롤의 조합으로 세포를 레이블링하는 것은 자세한 분석을위한 AMɸs 및 게이팅 파악, 배경 라벨링 설립을 허용합니다. polyanhydride와 폐포 macrophages의 치료MHC II, CD40, CD86, 그리고 CIRE (그림 3)의 증가 평균 형광 강도에 의해 그림과 같이 nanoparticles는 활성을 향상시킵니다.
. 그림 1 50:50 CPTEG : CPH 사전 (A)과 sonication의 (B) 30의 후 nanoparticles.
그림 2. 흐름 cytometric () 알렉사 형석 700 안티 CD11b 및 PE-Cy7 FMO 제어, (B) 알렉사 형석 700 FMO 제어 및 PE-Cy7 anti-F4/80으로 표시 수확 폐포 macrophages의 분석과 (C ) 알렉사 형석 700 안티 CD11b 및 PE-Cy7 anti-F4/80. 오른쪽 상단 모서리에있는 숫자는 이중 긍정 세포의 비율을 나타냅니다.
그림 3. Histograms은 형광 inten의 증가를 보여주는50:50 CPTEG와 폐포 macrophages의 공동 문화 이후에 MHC II (), CD40 (B), CD86 (C)와 CIRE (D) 표면 표현 sity : CPH polyanhydride은 48 시간 동안 nanoparticles. Histograms은 FMO 컨트롤로 표시 AMɸ에 대한 검색 결과 (묘사 
), 치료하지 AMɸ 모든 세포 표면 마커에 대한 항체로 분류 ( 
)과 AMɸ nanoparticles와 함께 배양해 및 모든 세포 표면 마커에 대한 항체로 분류 ( 
).
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Discussion
단일 선량 regimens 5 intranasally 실시하면 Polyanhydride의 nanoparticle 백신 플랫폼은 효능을 보여주었다. 이 백신 전달 플랫폼에 의해 유도된 폐의 주민 phagocytic 세포 인구의 활성화를 측정하는 것은 그것의 잠재적인 능력의 평가는 궁극적으로 적응 면역 반응을 촉진하도록 허용합니다.
특히, 폐 세척 유체에서 폐포 macrophages를 수확하고 nanoparticles의 다른 공법으로 그들을 치료하는 것은 항원 프레 젠 테이션 6,8로 이어지는, macrophages를 활성화하기 위해 서로 다른 입자 화학의 능력으로 통찰력을 제공합니다. 또한, 체외 연구에서 이들이 생체내 연구에 크고 더 복잡한에 착수하기 전에 폐포 macrophages를 활성화하기 위해 이러한 미립자 도움이되는 공법의 용량을 평가하는 데 유용합니다. 실험은 항상 surfac에 대한 긍정적인 제어 치료를 포함해야이러한 LPS, 수신자와 같은 수용체 4 작용제로서 전자는 마커까지 규제. 케어는이 프로토콜 한 실험에 여러 치료에 필요한 세포의 적절한 숫자를 생성하지 않을 수로 폐포 macrophages를 수확하기 전에 실험을 계획 촬영한다. 폐 lavages 따라서 더 많은 치료 그룹에있는 큰 실험에 적절한 셀 번호 (~ 5.0 마우스 회 × 10 5 세포) 수 있도록 여러 생쥐에서 수행해야 할 수도 있습니다. 폐 세척 기법은 다른 종족에 대한보고되었습니다, 그리고 활용 유체의 금액 (예, 마우스 폐 용량은 1 ML은 공부중인 수종에 비례, 쥐의 폐 용량은 10 ML과 인간의 폐 용량 6 패 17입니다.
Polyanhydride의 nanoparticles을 공식화하고 조기 표면 침식을 방지하기 위해 건조 분말 형태로 저장됩니다. 때문에 입자의 clumping의 결과는, sonication은 세포 배양에 추가하기 전에 필요하다고 정적 상호 작용. 이것의tep 제복 유통을 허용하고보다 재현성 결과로 이어집니다. 유동세포계측법를 사용하여 폐포 macrophages에 세포 표면 마커의 양을 정함은 강한 autofluorescence 신호에 의해 복잡하게된다. 이 장애물은 FACS의 항체 농도, 다색 fluorochrome 조합 및 유동세포계측법 캡처 매개 변수 (즉, 보상 컨트롤의 사용)를 최적화하여 극복할 수 있습니다. FMO 컨트롤은 한 번에 하나의 형광 매개 변수의 변경을 허용 각 항체에 대한 성문을 설정하기위한 유용하고 세포 표면 마커 표현의 정확한 양을 정함을 가능하게합니다. 생쥐의 변종의 차이는 특히 항체, MHC II의 haplotype의 특이성의 선택에 고려되어야한다.
이것이 크게 다른 연구소 및 기관 간의 소설 biomaterials의 비교를 용이하게하므로 그것은 폐에서 항원 제시 세포의 활성을 결정하는 표준 방법을 가지고하는 것이 중요합니다. 세대여기에 제시된 방법을 통해 폐포 macrophages의 일관성 인구 erating, nanoparticles의 다른 공법과 면역 향상 가능성에 관한 유용한 자료를 얻기위한 최적의 조건을 제공합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자를 위해 아이오와 주립 대학 유동세포계측법 시설에서 재정 지원과 박사 션 Rigby 위해 미군 의료 연구 및 Materiel 명령 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806)에 감사드립니다 그의 전문 기술 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
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