Summary
Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Biyobozunur nanopartiküller solunum yolu enfeksiyon hastalıklarına karşı yeni aşıların intranazal tasarlanması ve uygulanması için çok yönlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Spesifik olarak, polianhidrid alifatik sebasik asit (SA), aromatik 1,6-bis (p-karboksifenoksi) heksan (CPH), ya da amfifilik 1,8-bis (p-karboksifenoksi) -3,6-dioxaoctane oluşan nanoparçacıklar (CPTEG) benzersiz toplu ve yüzey erozyonu kinetik 1,2 gösterilecek ve yavaş yavaş in vivo 3,4,5 fonksiyonel biyomoleküllerin (örneğin, protein antijenleri, immünglobulinler, vb) serbest bırakmak için kullanılabilir. Bu onlara bir aşı dağıtım platformu 6,7,8 için mükemmel bir seçim yapmak, aynı zamanda sahip oldukları içsel adjuvan aktivite nanoparçacıklar.
Burun içi mukozal aşılamayı takiben doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak üzere, bir antijen p moleküler ve hücre yanıtları değerlendirilmesi gerekirbağışıklık yanıtı başlatmadan sorumlu alınıyoruz hücreler (APC). Alveoler makrofajların (AMɸ) akciğer parankimi 9,10,11 baskın sırasında dendritik hücreler, hava yollarında yürütülmesi bulunan başlıca APC'ler vardır. AMɸ mikrobiyal patojenler ve hücre artıkları 12,13 akciğerlerinde temizlenmesi son derece verimlidir. Ayrıca, bu hücre tipi bir adaptif bağışıklık yanıtının 9 başlamasında önemli bir ilk adımdır lenf düğümleri için mikrobiyal antijenlerin taşıma değerli bir rol oynar. AMɸ da doğuştan örüntü tanıma ve çöpçü reseptörleri, salgılar pro-enflamatuar mediatörler ve başbakan naif T hücrelerinin 12,14 yüksek seviyelerde ifade. AMɸ (ör., daha az% 80) arasında göreceli olarak saf popülasyonunun, laboratuarda çalışma için akciğer lavaj yoluyla elde edilebilir. AMɸ immün yetenekli hayvanlar hasat Resident encounte olacak makrofajların temsilcisi fenotipi sağlamakin vivo r parçacık tabanlı aşı. Bu yazıda, farelerden alınan hasat ve kültür AMɸ için kullanılan protokolleri tanımlamak ve in vitro polianhidrid nanopartiküller ile tedaviyi takiben makrofajların aktivasyonu fenotipi inceleyin.
Protocol
1. Akciğer Lavaj kullanarak Mouse Alveoler Makrofajlar (AMɸ) Hasat
- Böyle bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler, ve uygun göz koruması gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyiniz.
- Hasat başlamadan önce tam AMɸ (cAMɸ) orta hazırlayın. Penisilin / streptomisin Dulbelcco en Modified Eagle Medium (DMEM) ile 222,25 mL (kalem / Strep) çözeltisi, β-merkaptoetanol, 250 uL (2-merkaptoetanol), ve ısı inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS) ve 25 ml 2.5 ml ilave edilir. Vakum altında 0.2 mikron gözenek büyüklüğüne şişe top filtre kullanarak cAMɸ orta Filtre-sterilize edin.
- Bir euthanization odasında CO 2 boğularak sağlıklı bir fare Euthanize. Bir C57BL / 6 fare (6-8 haftalık) Proje amaçlar için kullanılmıştır, ancak bu akciğer lavaj tekniği fare herhangi suşu üzerinde gerçekleştirilebilir. Basınçlı gaz tüpleri kullanarak, ch fare vermeden önce 1 dakika için odasına gaz akışını izinodasının tamamen CO 2 ile dolu olduğundan emin olmak için sarı yanar. Fare euthanize için en az bir dakika boyunca odasında fare yerleştirin. Buna ek olarak, 1.4 'te tarif edildiği gibi fare ölümü teyit etmek için bir yöntem, fiziksel olarak kalp ponksiyonu ile her fareden asıl bulbus olfaktoryusları alındı.
- Arka (sırt tarafı),% 70 etanol ile sprey fare Lay, sternum bulup, karından 30 derecelik açıyla, göğüs boşluğuna 50 mm, 23 gauge iğne (1 ml şırınga bağlı) takın . Iğnenin doğru yerleştirilmesi ile, fare büyüklüğüne bağlı olarak kan 1-0,4 arasındaki mL toplamak için mümkün olacaktır. Vital bulguların kesilmesi için hayvan inceleyin.
- Onun karın (ventral tarafı) yatıyor böylece laboratuarlarında Yeri fare. Çalışma ortamı sterilize etmek için% 70 etanol ile Sprey fare. Yaklaşık yarım fare omurga aşağı cilt Pinch. % 70 etanol ile sterilize edilmiştir diseksiyon makas kullanarak, deri yoluyla küçük bir kesi yapmak. </ Li>
- Kesi her iki tarafında cilt kap ve fare beyin-kaudal ekseni boyunca zıt yönlerde cilt çekme. Doğru yapıldığı zaman, cilt alttaki karkas silinecektir.
- Fare boyun şimdi maruz kaslar ve bezlerin göstermelidir. Dikkatle bu doku kesme ve böylece fare gırtlak, soluk borusu, yemek borusu açığa forseps kullanarak fare öne doğru çekin. Juguler ven veya karotis arter kesme kaçının.
- Trakea şimdi görünür ve çevresinde kıkırdak halkaları ile doku olarak tanımlanabilir. Hafif forseps ile trakea tutun ve yavaşça kaldırın ve sırt tarafında bulunan yemek borusu, gelen trakea ayırın.
- Bir trakea ancak larinks posterior tuttuğu yerde küçük bir kesi anterior olun. Kesi yaklaşık 45 ° derecelik açıyla yapılmalıdır. Ayrıca, tamamen bu içine geri çekme önlemek olacak şekilde, trakea transect yokvücut boşluğu.
- Trakea lümenine kateter eklemek için hazırlık steril PBS ile bir Tom Cat kateter takılmış 1 cc şırınga doldurun. Forseps kullanarak trakea tutun ve elinizle kontrolünü artırmak ve yavaşça trakeal kesi eklemek için yakın uç kateter tutun. Yavaşça 20 mm trakea içine kateter yerleştirin. Diğer taraftan serbest bırakarak, kateter tüpünün etrafında olan trakea boğulacak.
- Kateter takılmış 1 ml şırınga yavaşça akciğerlere oda sıcaklığında, steril PBS 0.75 mL demini aldıktan sonra yavaşça PBS geri enjektöre aspire. Dışarıdan göğüs masaj yaparken bu işlemi üç kez tekrarlayın. Kateterden şırınga çıkarın ve 15 ml santrifüj tüpüne lavaj akıtın. Taze PBS 0.75 ml şırınga doldurma ve kateter için şırınga yeniden bağlamadan sonra, her bir fare için iki kez adımları 1.9 ve 1.10 tekrarlayın. Akışkan kurtarma az vo daha elde edilmesi, kısmi olabilirLume aşılamıştır. Birden fazla fareden hücreleri toplanması durumunda bütün akciğer yıkamasına yapılıncaya kadar, buz üzerinde toplanmış hücreleri ile 15 ml yerleştirilir.
2. Akciğer Lavaj AMɸ Hasat İşleme
- 4 azından 10 dakika için 250 ° C. x g'de santrifüje akciğer lavaj
- Bir biyogüvenlik kabini içinde uygun bir atık kabı içine steril tekniği, aktarmak süpernatant kullanma. Hafifçe bir test tüpü raf üstünde santrifüj tüpüne yan yatan tarafından hücre pelletini. Hücreleri yeniden süspanse etmek cAMɸ ortamın 1 ml ilave edilir.
- Coulter sayacı flakonda ISOTON II Diluent 10 ml içine hücrelerin 20 uL pipetleme bir Coulter Partikül Sayıcı Z1 kullanarak hücrelerin numaralandırılamıyor. , Şişeye Zap-oglobin II Parçalayıcı reaktif, 3 ila 4 damla yavaşça çevirin 3 ila 4 kez ve daha sonra bir hücre konsantrasyonunu elde etmek için tezgahın üzerine örnek şişesine yükleyin. Görüntülemek için 2 x 10 4 bir seyreltme faktörü ile karşı programlamak emin olunmL başına hücre sayısı olarak hücre konsantrasyonunu.
- CAMɸ orta kullanarak ml başına 2.5 x 10 5 hücreleri sulandırınız.
- Bir 6-de doku kültürü çanağı her oyuğuna 2.5 x 10 5 hücre / mL 'lik 2 mL dağıtın.
- Hücrelerin hem alt yapışma sağlamak için 6 saat süreyle% 5 CO2 içeren bir atmosfer 37 ° C nemlendirilmiş inkübatöründe içindeki AMɸ, inkübe kültür tabakları zenginleştirmek. Hafifçe yapışık hücreleri bozmayacak şekilde süpernatant aspire.
- Yapışmaz hücreleri ve enkaz kaldırmak için steril PBS (kalsiyum ve magnezyum ücretsiz) kullanarak kuyu durulayın. Her bir kuyucuğa cAMɸ orta 2 ml ilave edilir.
- Uyarıcılar ilave edilmeden önce, bir% 5 CO2 içeren bir atmosfer 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör içerisindeki bir gece boyunca inkübe hücreleri. Bu zenginleştirme adımdan sonra, hücreler, yaklaşık% 87 makrofaj belirteçler CD11b ve F4/80 (Şekil 2C) pozitiftir.
3. Polyanhydrid ilavesie Nanopartiküller ve Kontrol Tedaviler
- Polianhidrid anti-solvent nanoencapsulation 15 ile nanopartiküller imal. Bu süreçte, polimer metilen klorür içinde çözülmüştür (4 ° C'de 25 mg / mL 'lik bir konsantrasyonda) ve pentan (a oranı 1:200 metilen klorür az -20 ° C: pentane) içinde çökeltilmiştir.
- Sterilize doğru mikrogram miktarda ölçebilen bir denge kağıt ağırlığı kullanılarak polianhidrid nanopartiküller dışarı tartılır. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne parçacıkları ekleyin.
- Buz cAMɸ yılında nanopartiküller yeniden süspanse edin. Hesaplamalar ortamın fazla 0.3 'den mL Nanopartiküllerin istenen bir konsantrasyon elde etmek için, her oyuğa ilave edilir öyle yapılır. Nanopartiküller de kültüre eklenene kadar buz içinde tekrar süspanse edilir partikülleri tutmak.
- Önce AMɸ kültürlere nanopartiküller ekleyerek, bir mikrotip bir tezgah üstü sonikatör kullanarak parçacıkların ses dalgalarına maruz. % 70 Etanol ve wipin püskürterek mikrotip sterilizesonikasyon steril bir Kimwipe ile g. Buz üzerine tüp tutarken 30-45 s için 10-20 jul azından sonikasyon. Makroskopik nanoparçacık süspansiyon gözlemleyin. Parçacıklar yeterince dağılmış değilse, süspansiyon nanopartiküller 30-45 sn için tekrar sonicating önce polimerin cam geçiş sıcaklığının altında olmasını sağlamak için 1-2 dakika boyunca buz üzerinde ayarlamak için olanak sağlar. Bu sonikasyon adımın hedefi yeterince 50:50 CPTEG olarak, nanopartiküller dağıtmak için olan: sulu bir ortamda maruz kaldığında CPH nanopartiküller toplam eğilimindedir. Ancak, Nanopartiküllerin bazı küçük agrega hala askıda kalabilir.
- Nanopartikül süspansiyon (yeterince dağılmış) buz üzerinde tutulmalıdır ve erken yüzey erozyonu veya toplama önlemek için hemen kullanılmalıdır.
- Inkübatör gelen AMɸ ve biyogüvenlik kabini yer içeren kültür kaplarına çıkarın. Medi miktarı kapalı yaklaşık 45 derecelik bir açı ve pipet de Tilt plakaum olduğu nanoparçacık süspansiyonu (it 0,3 mL geçmemelidir) eklenecektir. Orta çıkartırken yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin.
- Vorteks önce uygun kuyulara eklemenin kısaca polianhidrid nanoparçacık süspansiyon. Belirli bir zamanda (s) içine nanoparçacık süspansiyonu (en fazla 0.3 'den mL) miktarı Pipeti, ancak kadar Pipeti ve aşağı karıştırılması. Bu eylem kuyudan AMɸ yapışık kesebilirsiniz. Parçacıklar iyi dibe ve hücreler temas edecek. Bu rapor özetlenen çalışmaları için, Nanopartiküllerin son konsantrasyon AMɸ ile birlikte kültüre 125 ug / ml olmuştur. Sonraki kuyular ve istenilen tedavi grupları ile devam edin. Bu tür tek orta ve 200 ng / mL lipopolisakkarid (LPS) tayin kuyucuklara olarak pozitif ve negatif kontrol gruplarına içerir.
- 37 ile kültür tabaklarında dönmek ° C'de 48 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe atmosfer ile nemlendirilmiş. Bizim Laboratuvar kinetik çalışmalarıy bu transkripsiyon ve meydana protein sentezi için yeterli bir zaman izin olarak hücre yüzey işaretleyici ifade ve sitokin salgı hem değerlendirmek için uygun kültürü periyodu olarak 48 saat göstermiştir. Sitokinlerin büyük seviyede uzun bir kültür dönemi (yani, 72 saat) boyunca biriktikçe, ancak bu zaman noktasında hücre yüzey işaretleyici ifade değerlendirilmeden sitokin seviyesi yüksek katkısı karmakarışık hale edilebilir. Yüzey işaretleyici ifadesinde değişiklikler nanopartiküller kendileri ile uyarılması ile doğrudan ilişki olmayabilir gözlenmiştir.
4. Akım Sitometri kullanarak AMɸ Aktivasyon Değerlendirilmesi
- Floresans-aktive hücre ayırma (FACS) tamponu (% 0.1 sodyum azit ve% 0.1 sığır serum albümini (BSA)) içinde 0.1 M fosfat önceden nanopartiküller o ile eş-kültüre edilmiştir kaplama makrofajlar hasat etmek (pH 7.4) tamponlu tuzlu hazırlamakr uyarıcılar.
- Engelleme tampon ve monoklonal antikor çözeltileri çalışma hazırlayın. Blok tampon hazırlamak için, FACS tampon içinde, sırasıyla, sıçan IgG (Sigma) ve anti-CD16/32 (eBioscience) için 1 mg / ml ve 10 ug / mL seyreltik. Üreticinin tavsiye konsantrasyonu veya kullanıcı optimize konsantrasyonu birine FACS tampon yüzey işaretleyici antikor paneli sulandırınız. Bu çalışma sunulan sonuçlar için, işaretleyici yüzey paneli MHC II, CD86, CD40 ve Cire (CD209) karşı antikorlar oluşur. Makrofaj işaretleri F4/80 ve CD11b karşı anti-fare antikorları da olumlu veri analizi sırasında makrofaj fenotipi belirlemek için panel dahildir. Kendilenmiş fare suşları genellikle kendi MHC II haplotipleri farklı olarak, MHC II moleküllerine karşı antikorlar seçerken dikkatli olunmalıdır. Seçilen antikorlar ilgi fare suşu tarafından ifade spesifik MHC antijenlerdir ile reaksiyona gerekir.
- 48 nanopartiküller ile inkübasyondan h ve / veya sonrauyarıcılar, 20 dakika boyunca buz üzerinde yer hücre kültürü yemekleri. Plakalardan yapışık makrofajlar kaldırmak için hafifçe 24 cm hücre kazıyıcı ile kuyu kazıyorum.
- Bir 5 mL serolojik pipet kullanılarak, yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek beş kez aşağı hücreleri ve orta yukarı ve aspire. Ayrı 5 ml polistiren tüpler içine bireysel kuyuların içeriğini Pipeti şekilde farklı deneysel tedaviler hücreleri birbirine karıştırmak değil.
- Her tüpe FACS tamponu 2 ml ilave edilir.
- 10 dakika süre ile 4 ° C'de 250 x g'de santrifüje hücrelerinin tüpler.
- Durusu bir test tüpü raf üstünde tüpler yan yatan tarafından kalan sıvı içinde yüzen ve yavaşça Pastör pipetiyle hücre pelletini.
- Monoklonal antikorların spesifik olmayan bağlanma önlemek için, hücreler her tüpe bloke edici tamponun 10 uL (4.2 'de hazırlanan) ilave edilir. Vorteks tüpler ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe.
- Her bir tüp ve incub seyreltilmiş monoklonal antikorlar uygun hacimde ekle15 dakika süreyle buz üzerinde karanlıkta yedi. Analiz edilecek örnekleri içeren tüpler polycromatic paneli (önceki antikorlar bileşimlerini optimize bireysel Labs yapılmalıdır) ve antikor kombinasyonu almalıdır. Ek kontrol gruplarına doğru ayrı ayrı tek renk kullanarak etiketli hücreleri karşılık etiketli değildi hücrelerin bir tüp dahil akış sitometresinde satın parametreleri, ve tazminat tüpler ayarlamak için dahil edilmelidir. Doğru akım sitometri analizi için kapıları ayarlamak için, Floresans Eksi Bir (FMO) kontrol edinimi sırasında dahil edilmelidir. FMO kontroller, kendi ilgili izotip kontrolü ile değiştirilir biri dışında panel üzerinde kullanılan tüm florokrom-konjuge antikorları ile etiketlenmiş hücreler vardır. Pozitif ve negatif popülasyonları (yani, tek başına bir pozitif kontrol uyarıcı ve orta ile tedavi edilen hücrelerin bölüntülerin ayrılması) da, FMO ve kompanzasyon kontrolü tüpler dahil edilmelidir.
- Bir test tüpünün raf üstünde tüpler yan yatan tarafından rezidüel sıvı Durusu süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini.
- Antikor paneli, bir florokrom doğrudan konjuge olmayan bir antikor oluşur ancak biyotin yerine konjuge olup, bir florokrom-konjuge streptavidin yüzey görsel işaretleyici için gereklidir. Bu adımda, seyreltilmiş florokrom-konjuge streptavidin uygun bir hacmi ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. 4.2 'de olduğu gibi, streptavidin Üretici tarafından tavsiye bir konsantrasyona ya da kullanıcı tarafından optimize edilmiş bir ila seyreltilmiş edilecektir. Bu adım sadece biyotinile primer antikorları içeren paneller için gereklidir.
- 4,10 olarak tanımlanan bir yıkama adımı gerçekleştirmek.
- BD deiyonize su içinde sabitleştirici 01:03 stabilize uygun bir hacim sulandırınız. Her tüpe seyreltilmiş sabitleştirici 100 uL ekle hafifçe vo sürehücrelerinin topaklanma önlemek için rtexing. Etiketli ve sabit hücrelerin stabil ° C Akış sitometresiyle satın alınmadan önce yaklaşık bir hafta boyunca 4 karanlıkta saklanabilir.
5.. Temsilcisi Veri
Adım 3.1 'fabrikasyon Nanopartiküller 163 ortalama çapı ± 24 nm ve daha önceki çalışmalarda elde edilen 5,16 ile tutarlı bir morfoloji vardı. Önceden sonikasyon ile ve sonra çözelti içinde Nanopartiküller partiküllerin sağlanması için yeterli bir dağılma sonication için ihtiyaç gösteren Şekil 1 'de gösterilmiştir. Akciğer lavaj yoluyla elde edilen hasat AMɸs akış sitometrik analizi Şekil 2 'de gösterilmiştir. Anti-fare CD11b ve anti-fare antikoru F4/80 yanı sıra, karşılık gelen kontrol FMO bir kombinasyonu ile etiketlenmesi hücreleri daha fazla analiz için AMɸs ve perdeleme tanımlanması, arka etiketleme olanak sağlamaktadır. Polianhidrid alveolar makrofajların TedavisiMHC II, CD40, CD86, ve Cire (Şekil 3) arasında yüksek ortalama floresans yoğunluğunu tarafından gösterildiği gibi nanopartiküller aktivasyon arttırır.
. Şekil 1 50:50 CPTEG: CPH önce (A) ve sonication (B) 30 sn sonra nanopartiküller.
Şekil 2. Flow sitometrik (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ve PE-Cy7 FMO Kontrol, (B) Alexa Fluor 700 FMO Kontrol ve PE-Cy7 anti-F4/80 etiketli hasat alveoler makrofajların analizi ve (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ve PE-Cy7 anti-F4/80. Sağ üst köşedeki sayısı çift pozitif hücrelerin yüzdesini temsil eder.
Şekil 3. Histogramlar floresans kütüphane olduğu söylenebilir bir artış gösteren50:50 CPTEG ile makrofaj eş-kültürden sonra MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) ve Cire (D) yüzey ifade sity: CPH polianhidrid 48 saat boyunca nanoparçacıklar. Histogramlar FMO kontrol olarak etiketlenmiş AMɸ sonuçları (tasvir 
), Tedavi edilmemiş AMɸ tüm hücre yüzey belirteçleri karşı antikorlar ile işaretli ( 
) Ve AMɸ nanopartiküller ile kültüre ve tüm hücre yüzey belirteçleri karşı antikorlar ile işaretli ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek doz rejimleri 5 intranazal uygulandığında polianhidrid nanoparçacık aşı platformları etkinliğini göstermiştir. Bu aşı dağıtım platformu tarafından uyarılan akciğerlerde ikamet fagositik hücre popülasyonlarının aktivasyon Ölçme potansiyel yeteneğinin değerlendirilmesi sonuçta adaptif bağışıklık yanıtları teşvik etmek için izin verir.
Özellikle akciğer lavaj sıvısında makrofaj hasat ve nanopartiküllerin farklı formülasyonları ile onları tedavi antijen sunumu 6,8 yol makrofajlar etkinleştirmek için farklı partikül kimyaları yetenekleri irdeliyoruz sağlar. Buna ek olarak, in vitro çalışmalar, bu in vivo çalışmalar daha büyük ve daha karmaşık başlamadan önce, makrofaj aktif hale getirmek için partikül adjuvan, bu formülasyonların kapasitesi değerlendirmek için kullanışlıdır. Deneyler, her Surfac için pozitif bir kontrol tedavisi içermelidirBu LPS, Toll benzeri reseptör 4 bir agonisti olarak e işareti up-regülasyonu,. Bakım Bu protokol bir deneyde birden tedaviler için gerekli hücreler yeterli sayıda üretmek olmayabilir olarak alveoler makrofajlar hasat öncesi Deneylerin planlanması alınmalıdır. Akciğer lavaj bu nedenle daha fazla tedavi grupları ile büyük deney için yeterli hücre sayıları (~ 5.0 fare başına x 10 5 hücre) sağlamak için birden çok fareler üzerinde yapılması gerekebilir. Akciğer lavaj teknikleri de diğer türler için bildirilmiştir ve kullanılan sıvı miktarı (yani, fare akciğer kapasitesi 1 mL çalışılan türler ile orantılıdır, sıçan akciğer kapasitesi 10 ml ve insan akciğer kapasitesi 6 L 17 dir.
Polianhidrid nanopartiküller formüle ve erken yüzeyi kaymasını engellemek için bir kuru toz formunda muhafaza edilir. Çünkü parçacıkların topaklanma sonuçlanan, sonication hücre kültürleri eklenmesinden önce gerekli olduğu statik etkileşimlerin. Bu sTEP yeknesak bir dağılım sağlar ve daha çoğaltılabilir sonuçlara yol açmaktadır. Akım sitometrisi alveoler makrofajlarda hücre yüzey belirteçlerinin ölçümü güçlü otofloresans sinyalleri tarafından karmaşıktır. Bu engel FACS antikor konsantrasyonları, polikromatik florokrom kombinasyonları ve akım sitometri yakalama parametreleri (örneğin, tazminat kontrollerin kullanımı) optimize ederek aşılabilir. FMO kontroller, bir kerede bir flüoresan parametrenin değişimi sağlayan her bir antikor için kapı ayarlama için yararlı olan ve hücre yüzeyi işaretleyici ifade doğru miktar sağlar. Farelerin suşları farklılıkları da özellikle antikorlar, MHC II haplotype spesifite seçimi göz önüne alınmalıdır.
Bu büyük ölçüde farklı laboratuarlar ve kurumlar arasında yeni biyomateryallerin karşılaştırmaları kolaylaştıracak olarak, akciğer antijen sunan hücrelerin aktivasyonunu belirlemek için standart bir yöntem olması önemlidir. GenBurada sunulan yöntemlerle alveoler makrofajların tutarlı nüfus hızlandırılma, nanopartiküllerin farklı formülasyonları ve bağışıklık güçlendirmeye potansiyeli açısından yararlı veriler elde etmek için en uygun koşulları sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar için Iowa State University Akım Sitometri Tesisi mali destek ve Dr Shawn Rigby için ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum Onun uzman teknik yardım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B.
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
