Høsting murint alveolære makrofager og evaluere Cellular Aktivering indusert av Polyanhydride Nanopartikler
Summary
Heri beskriver vi protokoller for høsting murine alveolære makrofager, som er bosatt medfødte immunceller i lungene, og undersøker deres aktivisering som svar på co-kulturen med polyanhydride nanopartikler.
Abstract
Nedbrytbare nanopartikler har dukket opp som en allsidig plattform for design og implementering av nye intranasal vaksiner mot luftveissykdommer smittsomme sykdommer. Spesielt nanopartikler polyanhydride sammensatt av alifatiske sebacic syre (SA), den aromatiske 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) heksan (CPH), eller den amfifile 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) vise unik bulk og overflate erosjon kinetikk 1,2 og kan utnyttes til å sakte frigjøre funksjonelle biomolekyler (f.eks protein antigener, immunglobuliner etc.) in vivo 3,4,5. Disse nanopartiklene også ha egenverdi adjuvant aktivitet, noe som gjør dem til et utmerket valg for en vaksine levering plattform 6,7,8.
For å belyse de mekanismer som styrer aktiveringen av medfødt immunitet etter intranasal mucosal vaksinasjon, må en vurdere de molekylære og cellulære responser av antigen presenting celler (APC) som er ansvarlige for å initiere immunreaksjoner. Dendrittiske celler er de viktigste APC funnet i gjennomføring luftveiene, mens alveolære makrofager (AMɸ) dominerer i lungene parenchyma 9,10,11. AMɸ er svært effektiv i å rydde lungene av mikrobielle patogener og celleavfall 12,13. I tillegg spiller denne celletype en verdifull rolle i transporten av mikrobielle antigener til drenering lymfeknuter, som er et viktig første skritt i initiering av en adaptiv immunrespons 9. AMɸ uttrykker også forhøyede nivåer av medfødt mønstergjenkjenning og scavenger reseptorer, skiller pro-inflammatoriske mediatorer, og prime naive T-celler 12,14. En relativt ren populasjon av AMɸ (f.eks høyere enn 80%) kan enkelt hentes via lunge lavage for studier i laboratoriet. Resident AMɸ høstet fra immun kompetente dyr gir et representativt fenotype av makrofager som vil encounter den partikkel-baserte vaksinen in vivo. Heri beskriver vi protokollene som brukes til å høste og kultur AMɸ fra mus og undersøke aktivering fenotypen av makrofager etter behandling med polyanhydride nanopartikler in vitro.
Protocol
Discussion
Polyanhydride nanopartikkel vaksine plattformer har vist effekt når det administreres intranasalt i endose regimer 5. Måling av aktivering av de fastboende phagocytic celle populasjoner i lungene forårsaket av denne vaksinen levering plattform tillater evaluering av sitt potensial evne til slutt fremme adaptive immunresponser.
Nærmere bestemt, høsting alveolære makrofager fra lunge lavage fluid, og behandle dem med ulike formuleringer av nanopartikler gir innsikt i evnene ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke den amerikanske Army Medical Research og forsyningskommando Command (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 og W81XWH-10-1-0806) for økonomisk støtte og Dr. Shawn Rigby fra Iowa State University flowcytometrisystemer Facility for hans ekspert teknisk assistanse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
