Summary

Høsting murint alveolære makrofager og evaluere Cellular Aktivering indusert av Polyanhydride Nanopartikler

Published: June 08, 2012
doi:

Summary

Heri beskriver vi protokoller for høsting murine alveolære makrofager, som er bosatt medfødte immunceller i lungene, og undersøker deres aktivisering som svar på co-kulturen med polyanhydride nanopartikler.

Abstract

Nedbrytbare nanopartikler har dukket opp som en allsidig plattform for design og implementering av nye intranasal vaksiner mot luftveissykdommer smittsomme sykdommer. Spesielt nanopartikler polyanhydride sammensatt av alifatiske sebacic syre (SA), den aromatiske 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) heksan (CPH), eller den amfifile 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) vise unik bulk og overflate erosjon kinetikk 1,2 og kan utnyttes til å sakte frigjøre funksjonelle biomolekyler (f.eks protein antigener, immunglobuliner etc.) in vivo 3,4,5. Disse nanopartiklene også ha egenverdi adjuvant aktivitet, noe som gjør dem til et utmerket valg for en vaksine levering plattform 6,7,8.

For å belyse de mekanismer som styrer aktiveringen av medfødt immunitet etter intranasal mucosal vaksinasjon, må en vurdere de molekylære og cellulære responser av antigen presenting celler (APC) som er ansvarlige for å initiere immunreaksjoner. Dendrittiske celler er de viktigste APC funnet i gjennomføring luftveiene, mens alveolære makrofager (AMɸ) dominerer i lungene parenchyma 9,10,11. AMɸ er svært effektiv i å rydde lungene av mikrobielle patogener og celleavfall 12,13. I tillegg spiller denne celletype en verdifull rolle i transporten av mikrobielle antigener til drenering lymfeknuter, som er et viktig første skritt i initiering av en adaptiv immunrespons 9. AMɸ uttrykker også forhøyede nivåer av medfødt mønstergjenkjenning og scavenger reseptorer, skiller pro-inflammatoriske mediatorer, og prime naive T-celler 12,14. En relativt ren populasjon av AMɸ (f.eks høyere enn 80%) kan enkelt hentes via lunge lavage for studier i laboratoriet. Resident AMɸ høstet fra immun kompetente dyr gir et representativt fenotype av makrofager som vil encounter den partikkel-baserte vaksinen in vivo. Heri beskriver vi protokollene som brukes til å høste og kultur AMɸ fra mus og undersøke aktivering fenotypen av makrofager etter behandling med polyanhydride nanopartikler in vitro.

Protocol

1. Høsting alveolære makrofager (AMɸ) fra Mus hjelp Lung lavage Bruk egnet personlig verneutstyr (PVU) som en labfrakk, engangshansker, og riktig øyebeskyttelse. Forbered komplett AMɸ (cAMɸ) medium før oppstart av innhøstingen. Legg 2,5 mL penicillin / streptomycin (penn / strep) løsning, 250 mL av β-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol), og 25 ml av varme inaktivert fosteret storfe serum (FBS) til 222,25 ml Dulbelcco modifiserte Eagle Medium (DMEM). Filter-sterilisere cAMɸ medium med en 0,…

Discussion

Polyanhydride nanopartikkel vaksine plattformer har vist effekt når det administreres intranasalt i endose regimer 5. Måling av aktivering av de fastboende phagocytic celle populasjoner i lungene forårsaket av denne vaksinen levering plattform tillater evaluering av sitt potensial evne til slutt fremme adaptive immunresponser.

Nærmere bestemt, høsting alveolære makrofager fra lunge lavage fluid, og behandle dem med ulike formuleringer av nanopartikler gir innsikt i evnene ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke den amerikanske Army Medical Research og forsyningskommando Command (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 og W81XWH-10-1-0806) for økonomisk støtte og Dr. Shawn Rigby fra Iowa State University flowcytometrisystemer Facility for hans ekspert teknisk assistanse.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
      cAM Media
DMEM Cellgro 15-013-CV  
50 mM 2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ML  
Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution Cellgro 30-002-CI  
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150  
      FACS Buffer
Sodium chloride Fisher Scientific S671-500  
Sodium phosphate Fisher Scientific MK7868500  
Potassium chloride Fisher Scientific P217500  
Potassium phosphate Fisher Scientific P288-200  
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A7888  
Sodium Azide Sigma S2002  
      Antibodies
Rat IgG Sigma I4341  
Anti-Ms CD16/32 eBioscience 16-0161  
Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) eBioscience 11-5321  
Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 Biolegend 105030  
Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC eBioscience 17-0401  
Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin eBioscience 13-2091  
Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0112  
Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 eBioscience 25-4801  
PE-Texas red conjugated Streptavidin BD Biosciences 551487  
      Other Supplies and Reagents
Ethanol Fisher Scientific A405-20 Used as 70% (v/v)
Compressed CO2 Linweld 16000060  
1 mL Syringe BD Biosciences 309659  
Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter Kendall 703021  
Biosafety Cabinet NUAIRE Series 22  
Dissection Scissors Fisher 138082  
Forceps Roboz RS-8254  
PBS, 1X without calcium and magnesium Cellgro 21-040-CM  
15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap VWR International 21008-216  
Six-well Tissue Culture Treated Plates Costar 3516  
Plastic Tube Racks Nalgene 5970  
Cell Scraper 24 cm TPP 99002  
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube Falcon 352008  
Pipet-aid XL Drummond 4-000-105  
10, 5, and 2 mL Pipettes Fisher 13-675  
200 and 10 μL micropipettors Gilson Pipetman F123601  
200 and 10 μL pipette tips Fisher 02-707  
BD Stabilizing Fixative BD Biosciences 338036  
Isoton II Diluent Beckman-Coulter 8546719  
Zap-oglobin II Lytic Reagent Beckman-Coulter 7546138  
Coulter Counter Polystyrene Vials Beckman-Coulter 14310-684  
Test Tubes BD Biosciences 352008  
      Equipment
Refrigerated Centrifuge Labnet 50075040  
Humidified Incubator CO2 Nuaire Model Autoflow 8500  
FACSCanto Flow Cytometer BD Biosciences 338960  
Coulter Particle Counter Z1 Beckman-Coulter WS-Z1DUALPC  
Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip Misonix Model No. S-4000  

References

  1. Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
  2. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
  3. Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
  4. Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
  5. Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
  6. Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
  7. Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
  8. Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
  9. Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
  10. Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
  11. Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
  12. Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
  13. Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
  14. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  15. Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
  16. Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
  17. Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).

Play Video

Cite This Article
Chavez-Santoscoy, A. V., Huntimer, L. M., Ramer-Tait, A. E., Wannemuehler, M., Narasimhan, B. Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles. J. Vis. Exp. (64), e3883, doi:10.3791/3883 (2012).

View Video