Summary
Häri beskriver vi protokoll för skörd murina alveolära makrofager, som är bosatta medfödda immunceller i lungan, och undersöka deras aktivering som svar på samodling med polyanhydrid nanopartiklar.
Abstract
Biologiskt nedbrytbara nanopartiklar har visat sig vara en mångsidig plattform för utformning och genomförande av nya intranasala vaccin mot luftvägssjukdomar smittsamma sjukdomar. Specifikt nanopartiklar polyanhydrid sammansatt av den alifatiska sebacinsyra (SA), den aromatiska 1,6-bis (p-karboxifenoxi) hexan (CPH) eller den amfifila 1,8-bis (p-karboxifenoxi) -3,6-dioxaoktan (CPTEG) visa unika bulk och yta kinetik erosion 1,2 och kan utnyttjas för att långsamt släppa funktionella biomolekyler (t.ex. proteinantigener, immunglobuliner, etc.) in vivo 3,4,5. Dessa nanopartiklar också ha inneboende adjuvant aktivitet, vilket gör dem ett utmärkt val för ett vaccin plattform 6,7,8.
För att belysa de mekanismer som styr aktiveringen av medfödda immuniteten efter intranasal slemhinnor vaccination måste man utvärdera de molekylära och cellulära svar från antigenet pterar celler (APC) som är ansvariga för initiering immunsvar. Dendritiska celler är de viktigaste APC som finns i luftvägarna, medan alveolära makrofager (AMɸ) dominerar i lungparenkym 9,10,11. AMɸ är mycket effektiva i att rensa lungorna hos mikrobiella patogener och cellrester 12,13. Dessutom spelar denna celltyp en värdefull roll i transporten av mikrobiella antigener till dränerande lymfkörtlar, vilket är ett viktigt första steg i initieringen av ett adaptivt immunsvar 9. AMɸ också uttrycka förhöjda halter av medfödda mönsterigenkänning och receptorer asätare, utsöndrar proinflammatoriska mediatorer och prime naiva T-celler 12,14. En relativt ren population av AMɸ (t.ex. större än 80%) kan lätt erhållas genom lungsköljning för undersökning i laboratoriet. Hemvist AMɸ skördas från immunkompetenta djur tillhandahålla en representativ fenotypen av makrofager som kommer encounter partikel-baserat vaccin in vivo. Häri beskriver vi de protokoll som används för att skörda och kultur AMɸ från möss och undersöka aktiveringen fenotypen av makrofager efter behandling med polyanhydrid nanopartiklar in vitro.
Protocol
1. Skördning alveolära makrofager (AMɸ) från mus med användning av lungsköljning
- Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), såsom en labbrock, engångshandskar och korrekt ögonskydd.
- Förbered komplett AMɸ (cAMɸ) medium innan initiering av skörd. Tillsätt 2,5 ml av penicillin / streptomycin (pen / strep)-lösning, 250 | il av β-merkaptoetanol (2-merkaptoetanol) och 25 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till 222,25 ml Dulbelcco s Modified Eagle Medium (DMEM). Filtersterilisera cAMɸ medium med användning av en 0,2 | im porstorlek flasktopp under vakuum.
- Euthanize en frisk mus av CO 2 kvävning i ett eutanasi kammare. Även om en C57BL / 6 mus (6-8 veckor gamla) användes för att detta projekt kan denna lungsköljning teknik utföras på någon stam av mus. Med hjälp av en komprimerad gas cylinder, låt gasflödet in i kammaren under 1 min före placera musen i lmgult för att säkerställa att kammaren är helt laddat med CO2. Placera musen i kammaren under minst en minut för att avliva musen. Dessutom exsanguinate varje mus via hjärtpunktion som en fysikalisk metod för att bekräfta mus död som beskrivits i 1,4.
- Lägg musen på rygg (ryggsidan), spraya med 70% etanol, lokalisera bröstbenet och vid en 30 graders vinkel från buken in en 23 gauge nål (ansluten till en 1 ml spruta) ca 50 mm i brösthålan . Med korrekt placering av nålen, bör det vara möjligt att samla in mellan 0,4 till 1 ml av blod beroende på storleken av musen. Undersök djuret för upphörande av vitala funktioner.
- Placera musen på lab bänk så att den ligger på sin mage (ventrala sida). Spray mus med 70% etanol för att sterilisera arbetsmiljön. Pinch skin ungefär halvvägs ner längs ryggraden hos musen. Använda dissekering sax som har steriliserats med 70% etanol, gör ett litet snitt genom huden. </ Li>
- Greppa huden på båda sidor om snittet och dra huden i motsatta riktningar längs den kraniala-kaudala axel mus. När du gjort korrekt, kommer huden tas bort från den underliggande kroppen.
- Halsen hos mus bör nu visa exponerade muskler och körtlar. Skär försiktigt den vävnaden och dra den mot den främre av musen med pincett, och därigenom utsätta struphuvud, luftstrupe och matstrupe av musen. Undvik att skära halsvenen eller halspulsådern.
- Luftstrupen är nu synligt och kan identifieras som vävnaden med brosk ringar runt det. Bräckligt hålla luftstrupen med pincett och försiktigt lyfta och separera trakea från matstrupen, som är belägen på den dorsala sidan.
- Gör ett litet snitt anterior där man håller luftstrupen, men posteriort om struphuvudet. Snittet skall göras vid ungefär en 45 ° grader. Också, inte helt transekt luftstrupen, eftersom detta kommer att hindra den från att dra sig tillbaka inkroppshåligheten.
- Fylla en 1 cc spruta försedd med en Tom Cat kateter med steril PBS i beredningen för att föra in katetern in i lumen av trakea. Håll luftstrupen med tång och med handen hålla katetern nära spetsen för att öka kontrollen och för försiktigt in den i trakeala snittet webbplatsen. Försiktigt in katetern i luftstrupen ca 20 mm. Gripa luftstrupen som är omkring kateterröret, vilket frigör den andra handen.
- Med hjälp av en 1 ml spruta med katetern försiktigt ingjuta 0,75 ml av rumstemperatur, steril PBS i lungorna och sedan försiktigt aspirera PBS tillbaka i sprutan. Upprepa denna procedur tre gånger medan externt massera bröstet. Koppla sprutan från katetern och dispensera sköljvätskan i ett 15 ml centrifugrör. Efter att ha fyllt sprutan med 0,75 ml färsk PBS och återansluta sprutan till katetern, upprepa steg 1,9 och 1,10 två gånger för varje mus. Fluid återhämtningen kan vara partiell, få mindre än VOLume infunderas. Om att samla in celler från mer än en mus, placera 15 ml röret med de skördade cellerna på is tills alla lung sköljningar har utförts.
2. Bearbetning av lungsköljning AMɸ Harvest
- Centrifugera lungsköljning fluidet vid 250 x g under 10 min vid 4 ° C.
- Använd steril teknik, dekantera supernatanten i lämplig avfallsbehållare i ett biosäkerhet skåp. Resuspendera cellpelleten genom att försiktigt skrapa centrifugrör över toppen av ett provrörsställ. Tillsätt 1 ml av cAMɸ mediet för att återsuspendera cellerna.
- Räkna cellerna med användning av en Coulter-räknare Z1 genom pipettering 20 | il av celler i 10 ml Isoton II diluent i Coulter-räknare flaskan. Tillsätt 3 till 4 droppar Zap-oglobin II lyseringsreagens in i flaskan, vänd försiktigt 3 till 4 gånger och sedan ladda provet flaskan på disken för att få en cell koncentration. Var noga med att programmera räknaren med en utspädning faktor 2 x 10 4 för att visacellkoncentration som antalet celler per ml.
- Späd celler i 2,5 x 10 5 per ml med användning av cAMɸ medium.
- Dispensera 2 ml av 2,5 x 10 5 celler / ml i varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- För att anrika för AMɸ, inkubera odlingsskålar inuti en 37 ° C fuktad inkubator med en 5% CO2 atmosfär under 6 timmar för att tillåta cellerna att vidhäfta till botten av brunnen. Försiktigt aspirera supernatanten inte störa vidhäftande celler.
- Skölj brunnarna med steril PBS (kalcium-och magnesiumfri) för att avlägsna icke vidhäftande celler och debris. Tillsätt 2 ml cAMɸ medium till varje brunn.
- Inkubera cellerna över natten i en 37 ° C fuktad inkubator med en 5% CO2 atmosfär före tillsats av stimulerande medel. Efter detta anrikningssteg, cirka 87% av cellerna är positiva för makrofag markörer CD11b och F4/80 (figur 2c).
3. Tillsats av Polyanhydride Nanopartiklar och behandlingar kontroll
- Tillverka nanopartiklar genom polyanhydrid anti-lösningsmedel nanoencapsulation 15. I denna process löses polymeren i metylenklorid (4 ° C vid en koncentration av 25 mg / ml) och utfälldes i pentan (-20 ° C vid ett förhållande 1:200 metylenklorid: pentan).
- Väg upp polyanhydrid nanopartiklar med steriliserade väger papper på en balans som exakt kan mäta mikrogram belopp. Tillsätt partiklar till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Omsuspendera nanopartiklar i iskall cAMɸ. Beräkningarna är gjorda så att inte mer än 0,3 ml medium tillsätts till varje brunn för att erhålla den önskade koncentrationen av nanopartiklar. Hålla de återsuspenderade partiklarna på is tills de nanopartiklar till odlingen brunn.
- Före tillsats av nanopartiklar till AMɸ kulturer, sonikera partiklar med användning av en sonikator bänk med en mikrospets. Sterilisera mikrospets genom sprutning med 70% etanol och wiping med en steril Kimwipe före ultraljudsbehandling. Sonikera på 10-20 joule i 30 till 45 s samtidigt röret på is. Observera nanopartiklar suspension makroskopiskt. Om partiklarna inte är tillräckligt dispergerat, tillåta suspensionen att ställa på is under 1 till 2 minuter för att säkerställa att nanopartiklarna är lägre än glasövergångstemperaturen för polymeren före sonikering igen under 30 till 45 sek. Avsikten med detta sonikering steg är att ett adekvat sätt dispergera nanopartiklar, såsom 50:50 CPTEG: CPH nanopartiklar har en tendens att aggregera när exponerade för en vattenhaltig miljö. Dock kan vissa små aggregat av nanopartiklar fortfarande i suspensionen.
- Nanopartiklar suspension (tillräckligt spridda) bör hållas på is och användas omedelbart för att förhindra för tidig ytan erosion eller aggregering.
- Ta bort odlingsskålama innehåller AMɸ från inkubatorn och plats i biosäkerhet skåpet. Tipp-plattan vid ungefär en 45 graders vinkel och pipetten av mängden läkeUM som kommer att läggas till nanopartikelsuspension (det bör inte överstiga 0,3 ml). Stör inte vidhäftande cellerna när du tar bort mediet.
- Vortex polyanhydriden nanopartikelsuspension kort innan du lägger den till lämpliga brunnar. Pipettera mängden nanopartikelsuspension (inte mer än 0,3 ml) i den specifika brunn (er), men inte pipettera upp och ned för att blandas. Denna åtgärd skulle kunna lossa fastsittande AMɸ från brunnen. Partiklarna kommer att sedimentera till botten av brunnen och i kontakt med cellerna. För de undersökningar som anges i denna rapport, var den slutliga koncentrationen av nanopartiklar samodlas med AMɸ 125 pg / ml. Fortsätt med efterföljande brunnar och önskade behandlingsgrupperna. Innefattar positiva och negativa kontrollprover grupper, såsom endast medium och 200 ng / ml lipopolysackarid (LPS) till utvalda brunnar.
- Återgå odlingsskålama till 37 ° C fuktad inkubator med en 5% CO2 atmosfär under 48 timmar. Kinetiska studier i vår laboratory har visat 48 timmar för att vara den optimala odlingsperioden för att utvärdera både cell-ytmarkör expression och cytokinutsöndring som den tillåter tillräcklig tid för transkription och protein-syntes sker. Även om högre nivåer av cytokiner ackumuleras under en längre odlingsperiod (dvs 72 timmar) kan utvärdera cellexpression ytan markör vid denna tidpunkt förväxlas med bidrag av förhöjda nivåer av cytokiner. Förändringarna i ytan markör uttryck observeras inte vara direkt hänförliga till stimulering med nanopartiklar själva.
4. Utvärdering AMɸ Aktivering med användning av flödescytometri
- Framställ fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS)-buffert (0,1% natriumazid och 0,1% bovint serumalbumin (BSA)) i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) före skörd av de strukna makrofager som har samodlade med nanopartiklar or stimulantia.
- Framställa arbetslösningar av den blockerande bufferten och de monoklonala antikropparna. För att framställa den blockbuffert, utspädd rått-IgG (Sigma) och anti-CD16/32 (eBioscience) till 1 mg / ml och 10 | ig / ml, respektive, i FACS-buffert. Späd ytpanelen markör-antikropp i FACS buffert för att antingen tillverkaren rekommenderade koncentrationen eller användaren optimerade koncentrationen. För de resultat som presenteras i detta arbete består ytmarkör panel av antikroppar mot MHC II, CD86, CD40 och CIRE (CD209). Anti-mus-antikroppar mot makrofag markörerna F4/80 och CD11b ingår också i panelen att positivt identifiera makrofag fenotypen vid dataanalys. Man måste vara försiktig när man väljer antikroppar mot MHC II molekyler, som inavlade musstammar ofta skiljer sig åt i sina MHC II haplotyper. De utvalda antikropparna måste reagera med de särskilda MHC alloantigener som framförts av musen stam av intresse.
- Efter 48 h av inkubation med nanopartiklar och / ellerstimulantia, plats cellodlingsskålar på is under 20 min. För att ta bort de vidhäftande makrofager från plattorna, försiktigt skrapa brunnar med en 24 cm-cell skrapa.
- Användning av en 5 ml serologisk pipett försiktigt aspireras celler och medium upp och ned fyra gånger för att generera en enkelcellsuspension. Pipettera innehållet i de enskilda brunnarna i separata 5 ml polystyrenrör för att inte blanda ihop celler från olika experimentella behandlingar.
- Tillsätt 2 ml FACS-buffert till varje rör.
- Centrifugera rören i celler vid 250 x g vid 4 ° C under 10 minuter.
- Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera cellpelleten i kvarvarande vätskan genom håva rören överst i ett provrör rack.
- För att förhindra icke-specifik bindning av de monoklonala antikropparna, tillsätt 10 | il blockerande buffert (framställd i 4,2) till varje rör av celler. Vortexrör och inkubera på is under 30 minuter.
- Tillsätt lämplig volym av utspädda monoklonala antikroppar till varje rör och incubåt i mörkret på is i 15 minuter. Rören som innehåller prover som skall analyseras skall erhålla den kombination av antikroppar av polycromatic panelen (tidigare optimering av kombinationen av antikroppar bör utföras av individuella Labs). Ytterligare kontroll, bör inkluderas för att korrekt ställa in ackvisitionsparametrar på flödescytometern, bland annat ett rör av celler som inte var märkta, och rör ersättning som motsvarar märkta celler med varje enskild färg för sig. För att korrekt konfigurera portarna för flödescytometrisk analys (FMO) fluorescensen Minus One kontroller bör ingå under förvärvet. FMO-kontroller är celler märkta med alla de fluorokromkonjugerade antikroppar, som används i panelen förutom en som ersätts av dess respektive isotypkontroll. Positiva och negativa populationer (dvs. separata alikvoter av celler som behandlats med en positiv kontroll stimulerande och medium enbart) bör också ingå i FMO och ersättning rör kontroll.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i kvarvarande vätskan genom räfsa rören över toppen av ett provrörsställ.
- Om antikroppen panelen består av en antikropp som inte är direkt konjugerad till en fluorokrom men är i stället konjugerad till biotin, är en fluorokrom-konjugerat streptavidin som behövs för att visualisera ytmarkören. I detta steg, tillsätt en lämplig volym av den utspädda fluorokrom-konjugerad streptavidin och inkubera i mörker under 15 min på is. Såsom i 4,2 kommer streptavidin spädas till en koncentration som rekommenderas av tillverkaren eller till en optimerad av användaren. Detta steg behövs bara för paneler som innehåller biotinylerade primära antikroppar.
- Utföra ett tvättningssteg som beskrivits i 4,10.
- Späd en lämplig volym av BD stabilisera fästande 1:3 i avjoniserat vatten. Tillsätt 100 pl av spädda fixativ till varje rör under försiktig vortexing att förhindra hopklumpning av celler. Märkta och fixerades celler stabilt kan lagras i mörker vid 4 ° C under ungefär en vecka före ackvisition på en flödescytometer.
5. Representativa data
Nanopartiklar framställs i steg 3,1 hade en genomsnittlig diameter av 163 ± 24 nm och en morfologi som överensstämmer med den som erhölls i tidigare studier 5,16. Nanopartiklar i lösningen före och efter sonikering visas i figur 1 för att demonstrera behovet av sonikering för att säkerställa adekvat dispergering av partiklarna. Flödescytometrisk analys av skördade AMɸs erhållna genom lungsköljning visas i figur 2. Märkning celler med en kombination av anti-mus CD11b och anti-mus F4/80 antikroppar samt motsvarande FMO kontrollerna möjliggör upprättandet bakgrunden märkning, identifiering AMɸs och styrande för vidare analys. Behandling av alveolära makrofager med polyanhydridnanopartiklar förbättrar aktivering såsom visas med den ökade genomsnittliga fluorescensintensiteten av MHC II, CD40, CD86, och CIRE (figur 3).
. Figur 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartiklar före (A) och efter (B) 30 s av sonikering.
Figur 2. Flödescytometrisk analys av skördade alveolära makrofager märkta med (A) Alexa Fluor 700-anti-CD11b och PE-Cy7 FMO Control (B) Alexa Fluor 700 FMO Control och PE-Cy7 anti-F4/80 och (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b och PE-Cy7 anti-F4/80. Numret i övre högra hörnet representerar andelen dubbel-positiva celler.
Figur 3. Histogram som visar en ökning i fluorescens avsiktsitet för ytexpression av MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) och CIRE (D) efter samodling av alveolära makrofager med 50:50 CPTEG: CPH polyanhydrid nanopartiklar under 48 timmar. Histogram visar resultat AMɸ märkta som FMO kontroller ( 
), Obehandlad AMɸ märkta med antikroppar mot alla cellytemarkörer ( 
) Och AMɸ odlades med nanopartiklar och märktes med antikroppar mot alla cellytemarkörer ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyanhydrid nanopartiklar vaccin plattformar har visat effekt när det ges intranasalt i enkel dos regimer 5. Mätning av aktivering av inhemska fagocytiska cellpopulationerna i lungorna orsakade av detta vaccin plattform medger utvärdering av dess potential förmåga att slutligen främja adaptiva immunsvar.
Specifikt skörd alveolära makrofager från lungsköljning vätska och behandla dem med olika formuleringar av nanopartiklar ger insikter i förmåga olika partikel kemier att aktivera makrofager, vilket leder till antigenpresentation 6,8. Dessutom är dessa in vitro-studier är användbara för att bedöma kapaciteten hos dessa formuleringar partiklar adjuvant att aktivera alveolära makrofager före inleder större och mer komplexa in vivo-studier. Experiment ska alltid innehålla en positiv kontroll behandling för SURFACe markör uppreglering, såsom LPS, en agonist av Toll-like receptor 4. Försiktighet bör iakttas vid planering av experiment innan skörd alveolära makrofager eftersom detta protokoll inte kan ge tillräckligt många celler som behövs för flera behandlingar i ett experiment. Lung sköljningar kan därför behöva göras på flera möss för att säkerställa tillräckliga cellantal (~ 5,0 x 10 5 celler per mus) för större försök med mer behandlingsgrupper. Lungsköljning tekniker har också rapporterats för andra arter, och mängden som används vätska är proportionell mot de arter som studerats (dvs, mus lungkapacitet är 1 ml, råtta lungkapacitet 10 ml och mänskliga lungkapacitet är 6 L 17.
Polyanhydrid nanopartiklar bereds och lagras i en torr pulverform för att förhindra för tidig yterosion. På grund av statiska interaktioner som resulterar i klumpning av partiklarna, är sonikering nödvändigt före tillsats till cellkulturer. Detta artep tillåter enhetlig fördelning och leder till mer reproducerbara resultat. Kvantifiering av cellytmarkörer på alveolära makrofager med användning av flödescytometri kompliceras av starka autofluorescens signaler. Detta hinder kan övervinnas genom att optimera FACS antikroppskoncentration och polykromatiska fluorokrommängder kombinationer, och flödescytometri parametrar Capture (dvs. användning av ersättning kontroller). FMO kontroller tillåta byte av en fluorescerande parametern vid en tidpunkt, är användbara för fastställande grindar för varje antikropp och möjliggöra korrekt kvantifiering av cellytemarkör uttryck. Skillnader i stammar av möss bör också övervägas vid val av antikroppar, särskilt haplotyp specificitet av MHC II.
Det är viktigt att ha standardiserade metoder för att bestämma aktivering av antigen-presenterande celler i lungan, eftersom detta kommer att i hög grad underlätta jämförelser av nya biomaterial mellan olika laboratorier och institutioner. Genbetsvilliga konsekventa populationer av alveolära makrofager genom de metoder som presenteras här ger optimala förutsättningar för att erhålla användbara uppgifter om olika formuleringar av nanopartiklar och deras immunförsvar öka potential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 och W81XWH-10-1-0806) för finansiellt stöd och Dr Shawn Rigby från Iowa State University flödescytometri Anläggning för hans sakkunnig tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
