Summary
Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.
Abstract
Biologisch afbreekbare nanodeeltjes naar voren zijn gekomen als een veelzijdig platform voor het ontwerp en implementatie van nieuwe intranasale vaccins tegen respiratoire infectieziekten. Specifiek, polyanhydride nanodeeltjes bestaande uit alifatische sebacinezuur (SA) de aromatische 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) hexaan (CPH) of de amfifilische 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) weer te geven unieke bulk-en oppervlakte-erosie kinetiek 1,2 en kan worden benut om langzaam functionele biomoleculen (bijvoorbeeld eiwit antigenen, immunoglobulinen, etc.) laat in vivo 3,4,5. Deze nanodeeltjes bezitten ook intrinsieke adjuvant activiteit, waardoor ze een uitstekende keuze voor een vaccin platform voor de levering 6,7,8.
Om de mechanismen die de activering van aangeboren immuniteit na intranasale mucosale vaccinatie toe te lichten, moet men de evaluatie van de moleculaire en cellulaire reacties van het antigeen phekel cellen (APC's) die verantwoordelijk is voor het initiëren van immuunreacties. Dendritische cellen zijn de voornaamste APC's gevonden in het uitvoeren van de luchtwegen, terwijl de alveolaire macrofagen (AMɸ) overheersen in het longparenchym 9,10,11. AMɸ zijn zeer efficiënt in het opruimen van de longen van microbiële ziekteverwekkers en celresten 12,13. Bovendien is dit type cel speelt een belangrijke rol in het vervoer van microbiële antigenen aan de drainerende lymfeklieren, dat is een belangrijke eerste stap in de inleiding van een adaptieve immuunrespons 9. AMɸ ook uitdrukking verhoogde niveaus van aangeboren patroonherkenning en scavenger receptoren, scheiden pro-inflammatoire mediatoren, en eerste naïeve T-cellen 12,14. Een relatief zuivere populatie van AMɸ (bijv. meer dan 80%) kan eenvoudig worden verkregen via de longen lavage voor studie in het laboratorium. Resident AMɸ geoogst van immuuncompetente dieren zorgen voor een vertegenwoordiger fenotype van de macrofagen die encounter de deeltjes gebaseerd vaccin in vivo. Hierin beschrijven we de protocollen die worden gebruikt om te oogsten en cultuur AMɸ van muizen en onderzoekt de activering fenotype van de macrofagen na behandeling met polyanhydride nanodeeltjes in vitro.
Protocol
1. Oogsten alveolaire macrofagen (AMɸ) van de muis met behulp van Lung Lavage
- Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals een laboratoriumjas, wegwerphandschoenen, en een goede oogbescherming.
- Bereid volledige AMɸ (cAMɸ) medium voor de aanvang van de oogst. Voeg 2,5 ml penicilline / streptomycine (pen / strep) oplossing, 250 ul van β-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol) en 25 ml hitte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) tot 222,25 ml Dulbelcco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM). Filter-steriliseren cAMɸ medium met behulp van een 0,2 micrometer poriegrootte fles bovenste filter onder vacuüm.
- Euthanaseren van een gezonde muis door CO 2 stikken in een euthanization kamer. Hoewel C57BL / 6 muis (6-8 weken oud) werd gebruikt voor dit project kan deze long lavage techniek worden uitgevoerd op een stam van de muis. Met behulp van een cilinder met samengeperst gas-, gas-stroom in de kamer voor te laten gedurende 1 minuut aan het plaatsen van de muis in de lamber om te verzekeren dat de kamer volledig is opgeladen met CO 2. Plaats de muis in de kamer voor ten minste een minuut om de muis te euthanaseren. Bovendien exsanguinate elke muis via hartpunctie als fysische methode voor muizen dood bevestigen beschreven in 1.4.
- Leg de muis op zijn rug (dorsale zijde), spray met 70% ethanol, zoekt u het borstbeen en, in een hoek van 30 graden uit de buik, een 23 gauge naald (aangesloten op een 1 ml spuit) plaats ongeveer 50 mm in de borstholte . Met de juiste plaatsing van de naald moet het mogelijk zijn tussen 0,4 en 1 ml bloed, afhankelijk van de grootte van de muis verzamelen. Onderzoek het dier voor de beëindiging van de vitale functies.
- Plaats muis op laboratoriumtafel zodat ligt op het achterlijf (buikzijde). Spray muis met 70% ethanol om de werkomgeving te steriliseren. Knijp de huid ongeveer halverwege de rug van de muis. Met behulp van dissectie schaar die zijn gesteriliseerd met 70% ethanol, een kleine incisie door de huid. </ Li>
- Pak de huid aan beide zijden van de insnijding en trek de huid in tegengestelde richtingen langs de craneo caudale as van de muis. Wanneer dit juist gebeurt, zal de huid worden verwijderd uit de onderliggende karkas.
- De hals van de muis moet nu blootgesteld spieren en klieren. Knip voorzichtig dat weefsel en trek hem naar het voorste deel van de muis met behulp van een tang, waardoor het blootstellen van het strottenhoofd, de luchtpijp en de slokdarm van de muis. Vermijd het snijden van de halsader of halsslagader.
- De luchtpijp is nu zichtbaar en kan worden gezien als het weefsel met kraakbenige ringen er omheen. Fijn houdt de luchtpijp met een tang en til en scheiden de trachea van de slokdarm, welke aan de rugzijde.
- Maak een kleine incisie anterior naar de plaats waar men houdt van de luchtpijp, maar achterste aan het strottenhoofd. De insnijding worden bij ongeveer 45 ° graden. Ook niet helemaal doorsnijden van de luchtpijp, omdat dit te voorkomen terugtrekken inde lichaamsholte.
- Vul een 1 cc injectiespuit voorzien van een Tom Cat katheter met steriele PBS in voorbereiding om de katheter in te brengen in het lumen van de luchtpijp. Houd de luchtpijp met behulp van pincet en met je hand de catheter in de buurt van de tip om de controle te vergroten en steekt hem voorzichtig in de tracheale incisie site. Steek de katheter in de trachea ongeveer 20 mm. Pak de trachea die rond de katheter, vrij anderzijds.
- Met een 1 ml injectiespuit voorzien van de katheter voorzichtig trekken 0,75 ml kamertemperatuur steriele PBS in de longen en Zuig de PBS terug spuit. Herhaal dit proces drie keer, terwijl buiten het masseren van de borst. Haal de spuit uit de katheter en breng de lavage vloeistof in een 15 ml centrifugebuis. Na het vullen van de spuit met 0,75 ml vers PBS en opnieuw aansluiten van de spuit aan de katheter, herhaalt u de stappen 1,9 en 1,10 twee keer voor elke muis. Fluid herstel kan gedeeltelijk, het verkrijgen van minder dan de volume toegediend. Als het verzamelen van cellen van meer dan een muis, zet de 15 ml buis met de geoogste cellen op ijs totdat alle long lavages zijn uitgevoerd.
2. Verwerking van Lung Lavage AMɸ Harvest
- Centrifugeer longen wasvloeistof 250 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Met behulp van steriele techniek, giet bovenstaande vloeistof in een geschikte afvalbak in een bioveiligheid kast. Resuspendeer de celpellet door voorzichtig harken de centrifugebuis aan de bovenkant van een reageerbuis rek. Voeg 1 ml cAMɸ medium aan de cellen kunnen mengen.
- Som de cellen met een Coulter deeltjesteller Z1 door het pipetteren 20 pi cellen in 10 ml Isoton II oplosmiddel in Coulter Counter flacon. Voeg 3 tot 4 druppels van de Zap-oglobin II lytische reagens in flacon, voorzichtig omdraaien 3 tot 4 keer en dan is het monster flacon te laden op de teller naar een cel concentratie te verkrijgen. Zorg ervoor dat de teller te programmeren met een verdunningsfactor van 2 x 10 4 om het schermcelconcentratie het aantal cellen per ml.
- Verdun cellen tot 2,5 x 10 5 per ml met cAMɸ medium.
- Breng 2 ml van 2,5 x 10 5 cellen / ml in elk putje van een 6-wells weefselkweekplaten schotel.
- Om verrijken AMɸ, geïncubeerd kweekschalen in een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2 atmosfeer gedurende 6 uur om cellen te houden aan de bodem van de put. Zuig het supernatant om niet hechtende cellen te verstoren.
- Spoel de putjes met steriele PBS (calcium en magnesium vrij) niet-hechtende cellen en resten te verwijderen. Voeg 2 ml cAMɸ medium aan elk putje.
- Incubeer voorafgaande cellen overnacht in een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2 atmosfeer toevoeging van stimulerende. Na deze verrijkingsstap ongeveer 87% van de cellen positief voor de macrofaag markers CD11b en F4/80 (figuur 2c).
3. Toevoeging van Polyanhydride Nanodeeltjes en Control Behandelingen
- Vervaardig nanodeeltjes via polyanhydride anti-solvent nanoencapsulation 15. Hierbij wordt het polymeer opgelost in methyleenchloride (4 ° C bij een concentratie van 25 mg / ml) en neergeslagen in pentaan (-20 ° C in een verhouding 1:200 methyleenchloride: pentaan).
- Weeg polyanhydride nanodeeltjes door middel van gesteriliseerd papier te wegen op een balans die nauwkeurig kan meten microgram bedragen. Voeg deeltjes met een 1,5 mL microcentrifugebuisje.
- Resuspendeer de nanodeeltjes in ijskoude cAMɸ. De berekeningen zijn zodat niet meer dan 0,3 ml medium toegevoegd aan elk putje om de gewenste concentratie van nanodeeltjes te verkrijgen. Houd de geresuspendeerde deeltjes op ijs tot de nanodeeltjes aan de kweek toegevoegd zijn.
- Voorafgaand aan het toevoegen van de nanodeeltjes aan de AMɸ culturen, ultrasone trillingen deeltjes met behulp van een bankje top ultrasoonapparaat met een microtip. Steriliseer microtip door te besproeien met 70% ethanol en wiping met een steriele Kimwipe voor sonicatie. Ultrasone trillingen bij 10-20 joules 30 tot 45 s terwijl de buis op ijs. Macroscopisch Let op nanodeeltjes schorsing. Indien deeltjes onvoldoende verspreid, zodat de suspensie op ijs gezet gedurende 1 tot 2 minuten dat de nanodeeltjes onder de glasovergangstemperatuur van het polymeer voordat sonicatie weer 30 tot 45 sec. De bedoeling van deze sonificatie stap voldoende dispergeren de nanodeeltjes als 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes vaak totale bij blootstelling aan een waterig milieu. Echter, sommige kleine aggregaten van nanodeeltjes nog steeds in de suspensie.
- Nanodeeltjes suspensie (voldoende verspreid) moet worden bewaard op ijs en worden onmiddellijk wordt gebruikt voor vroegtijdige oppervlakte-erosie of aggregatie te voorkomen.
- Verwijder de cultuur gerechten met de AMɸ van de incubator en plaats in de bioveiligheid kast. Tilt plaat op ongeveer een hoek van 45 graden en de pipet uit de hoogte van medium die worden toegevoegd aan de suspensie nanodeeltjes (mag niet hoger dan 0,3 ml). Niet storen de hechtende cellen bij het verwijderen van het medium.
- Vortex de polyanhydride nanodeeltjes schorsing kort voorafgaand aan toe te voegen aan de juiste bronnen. Pipetteer de hoeveelheid nanodeeltjes suspensie (niet meer dan 0,3 ml) in de specifieke bron (s), maar niet pipetteer op en neer om te mengen. Deze actie kan AMɸ los van de aanhanger uit de put. De deeltjes op de bodem van de put en contact cellen. Voor studies beschreven in dit rapport, de eindconcentratie van nanodeeltjes samen gekweekt met AMɸ was 125 pg / ml. Ga verder met de volgende putten en gewenste behandelingsgroepen. Inclusief de positieve en negatieve controle groepen, zoals als medium alleen en 200 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) de aangewezen bronnen.
- Breng de kweekschalen de 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO2 atmosfeer gedurende 48 uur. Kinetische studies in onze laboratory hebben aangetoond dat 48 uur om de optimale cultuur periode voor het evalueren van zowel celoppervlak marker expressie en cytokine secretie als het mogelijk maakt voldoende tijd voor de transcriptie en eiwitsynthese te komen zijn. Hoewel de hogere niveaus van cytokines ontstaan bij een langere cultuur periode (dat wil zeggen, 72 uur), kan de evaluatie van het celoppervlak marker uitdrukking op dit tijdstip worden verward door de bijdrage van de verhoogde niveaus van cytokinen. De veranderingen in de oppervlakte marker expressie vastgesteld, kunnen niet direct toe te schrijven aan stimulatie met de nanodeeltjes zelf.
4. Het evalueren van AMɸ Activering met behulp van flowcytometrie
- Bereid fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (0,1% natriumazide en 0,1% runderserumalbumine (BSA)) in 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) voor het oogsten de geïllustreerde macrofagen die zijn samen gekweekt met nanodeeltjes or stimulerende middelen.
- Bereid te werken oplossingen van de blokkerende buffer en de monoklonale antilichamen. Om het blok buffer bereiden verdunnen rat IgG (Sigma) en anti-CD16/32 (eBioscience) tot 1 mg / ml en 10 pg / ml, in FACS-buffer. Verdun oppervlak merker-antilichaam paneel in FACS-buffer hetzij de fabrikant aanbevolen concentratie of de gebruiker geoptimaliseerde concentratie. Voor de resultaten die in dit werk, het oppervlak marker panel bestaat uit antilichamen tegen MHC II, CD86, CD40 en CIRE (CD209). Anti-muis antilichamen tegen de macrofaag markers F4/80 en CD11b zijn ook opgenomen in het paneel aan de macrofaag fenotype positief te identificeren tijdens de data-analyse. Voorzichtigheid is geboden bij het selecteren van antilichamen tegen MHC II moleculen, zoals inteelt muizenstammen verschillen vaak in hun MHC II haplotypes. De geselecteerde antilichamen moet reageren met de specifieke MHC allo-antigenen die door uw muis stam van belang.
- Na 48 uur incubatie met nanodeeltjes en / ofstimulerende middelen, plaats celkweek gerechten op ijs gedurende 20 minuten. Om de aanhanger macrofagen van de platen te verwijderen, voorzichtig schrapen putten met een 24 cm cel schraper.
- Een 5 ml serologische pipet Zuig de cellen en medium op en neer vijfmaal een celsuspensie gegenereerd. Pipetteer de inhoud van afzonderlijke putjes in afzonderlijke 5 ml polystyreen buizen zodat geen mengen cellen verschillende experimentele behandeling.
- Voeg 2 ml FACS-buffer aan elke buis.
- Centrifugebuis cellen bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Giet supernatant voorzichtig Resuspendeer celpellet in resterende vloeistof door harken de buizen aan de bovenkant van een reageerbuis rek.
- Om niet-specifieke binding van monoklonale antilichamen voorkomen, wordt 10 uL blokkeringsbuffer (bereid 4.2) aan elke buis van cellen. Vortex buizen en op ijs incuberen gedurende 30 minuten.
- Voeg het juiste volume van de verdunde monoklonale antilichamen aan elke buis en incubaten in het donker op ijs gedurende 15 minuten. Buizen die monsters bevatten te analyseren dienen de bij de combinatie van antilichamen van de polycromatic panel (vorige optimalisatie van de combinatie van antilichamen moeten uitgevoerd door individuele laboratoria worden). Extra controle groepen moeten worden opgenomen om juist ingesteld de acquisitie parameters op de flowcytometer, met inbegrip van een buis van cellen die niet werden bestempeld, en compensatie buizen die overeenkomen met gelabelde cellen met behulp van elke afzonderlijke kleur apart. Voor een juiste keuze de poorten voor flowcytometrische analyse, de Fluorescentie Minus One (FMO) controles moeten worden genomen tijdens de overname. FMO controles cellen gelabeld met het fluorochroom-geconjugeerde antilichamen die het paneel op een na die wordt vervangen door de respectieve isotypecontrole. Positieve en negatieve populaties (dat wil zeggen, afzonderlijke fracties van cellen behandeld met een positieve controle stimulerend middel en medium alleen) moeten ook worden opgenomen in de FMO en de compensatieregeling, buizen.
- Giet supernatant en resuspendeer celpellet in resterende vloeistof door harken de buizen aan de bovenkant van een reageerbuis rek.
- Als het antilichaam paneel bestaat uit een antilichaam niet direct geconjugeerd aan een fluorochroom, maar maakt geconjugeerd aan biotine wordt een fluorochroom-geconjugeerde streptavidine nodig om het oppervlak marker visualiseren. In deze stap, voeg toe een passende volume van de verdunde fluorochroom-geconjugeerde streptavidine en incubeer in het donker gedurende 15 minuten op ijs. Zoals in 4.2 wordt de streptavidine worden verdund tot een concentratie aanbevolen door de fabrikant of een geoptimaliseerd door de gebruiker. Deze stap is alleen nodig voor panelen met gebiotinyleerde primaire antilichamen.
- Voer een wasstap beschreven in 4.10.
- Verdun een zodanige hoeveelheid van de BD stabiliseren fixatief 01:03 in gedeïoniseerd water. Voeg 100 ul van verdunde fixatief aan elke buis, terwijl voorzichtig vortexing voorkomen samenklonteren van cellen. Gelabelde cellen gefixeerd en stabiel kan worden in het donker bewaard bij 4 ° C gedurende ongeveer een week voor de verkrijging van een flow cytometer.
5. Representatieve gegevens
Nanodeeltjes vervaardigd in stap 3.1 een gemiddelde diameter van 163 ± 24 nm en een morfologie overeen met die verkregen in eerdere studies 5,16. Nanodeeltjes in oplossing vóór en na sonificatie zijn weergegeven in figuur 1 de noodzaak van sonificatie tonen voldoende dispersie van de deeltjes te waarborgen. Flow cytometrische analyse van geoogst AMɸs verkregen via long lavage is weergegeven in figuur 2. Labelen cellen met een combinatie van anti-muis CD11b en anti-muis antilichamen F4/80 alsmede de overeenkomstige FMO mogelijk maakt voor het vaststellen achtergrond etikettering identificeren AMɸs en gating voor verdere analyse. De behandeling van alveolaire macrofagen met polyanhydridenanodeeltjes verbetert activering zoals aangegeven door de hogere gemiddelde fluorescentie-intensiteit van MHC II, CD40, CD86, en CIRE (figuur 3).
. Figuur 1 50:50 CPTEG: CPH nanodeeltjes voor (A) en na (B) 30 s van sonificatie.
Figuur 2. Flowcytometrische analyse van geoogst alveolaire voorzien (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b en PE-Cy7 FMO Control, (B) Alexa Fluor 700 FMO controle en PE-Cy7 anti-F4/80 en (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b en PE-Cy7 anti-F4/80. Het aantal in de rechter bovenhoek geeft het percentage dubbele-positieve cellen.
Figuur 3. Histogrammen tonen een verhoging van de fluorescentie intenteit voor oppervlakte-expressie van MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) en CIRE (D) na co-cultuur alveolaire met 50:50 CPTEG: CPH polyanhydride nanodeeltjes gedurende 48 uur. Histogrammen tonen resultaten voor AMɸ gelabeld als FMO controles ( 
), Onbehandelde AMɸ voorzien antilichamen tegen celoppervlaktemerkers ( 
) En AMɸ gekweekt met nanodeeltjes en voorzien van antilichamen tegen alle celoppervlaktemerkers ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyanhydride nanodeeltjes vaccin platforms hebben laten zien werkzaamheid indien intranasaal toegediend in een enkele dosis regimes 5. Het meten van de activering van de bewoner fagocytaire celpopulaties in de longen geïnduceerd door het vaccin afgifte, maakt evaluatie van de potentiële mogelijkheid om uiteindelijk te bevorderen adaptieve immuunrespons.
In het bijzonder, het oogsten van alveolaire macrofagen van de long lavage vloeistof en ze te behandelen met verschillende formuleringen van de nanodeeltjes geeft inzicht in de bekwaamheden van de individuele deeltjes chemicaliën om macrofagen te activeren, wat leidt tot antigeen presentatie 6,8. Bovendien zijn deze in vitro studies zijn nuttig voor de beoordeling van de capaciteit van deze deeltjes adjuvant formuleringen te activeren voordat alveolaire macrofagen tot het aanbreken van grotere en meer complexe in vivo studies. Experimenten moet altijd een positieve controle behandeling voor oppervlakteactievee marker up-regelgeving, zoals LPS, een agonist van Toll-like receptor 4. Voorzichtigheid is geboden bij het plannen van experimenten vóór de oogst alveolaire macrofagen als dit protocol kan soms niet voldoende aantallen cellen die nodig zijn voor meerdere behandelingen in een experiment. Lung lavages kan daarom dienen te worden uitgevoerd op meerdere muizen voldoende aantal cellen (~ 5,0 x 10 5 cellen per muis) zorgen voor grotere experimenten met meer behandelingsgroepen. Lung lavage technieken zijn ook gemeld voor andere soorten, en de hoeveelheid van de gebruikte vloeistof is evenredig met de soort bestudeerd (dat wil zeggen, muis longcapaciteit is 1 ml, rat longcapaciteit is 10 ml en menselijke longcapaciteit is 6 L 17.
Polyanhydride nanodeeltjes worden geformuleerd en opgeslagen in een droge poedervorm om voortijdige oppervlakte-erosie te voorkomen. Door statische interacties die resulteren in samenklonteren van de deeltjes, sonicatie nodig is voor toevoeging aan cel culturen. Dit stap maakt gelijkmatige verdeling en leidt tot meer reproduceerbare resultaten. De kwantificering van celoppervlaktemerkers op alveolaire macrofagen met behulp van flowcytometrie wordt bemoeilijkt door een sterke autofluorescentie signalen. Dit obstakel kan worden overwonnen door het optimaliseren van FACS antilichaamconcentraties, polychromatische fluorochroom combinaties en flowcytometrie capture parameters (dat wil zeggen, het gebruik van de schadevergoeding controles). FMO besturingselementen kunnen de wijziging van een fluorescerende parameter tegelijk bruikbaar voor het instellen poorten per antilichaam mogelijk juiste kwantificering van celoppervlaktemarker expressie. Verschillen in de muizenstammen moet ook worden overwogen in de selectie van antilichamen, in het bijzonder haplotype specificiteit van MHC II.
Het is belangrijk gestandaardiseerde te activeren van antigeen presenterende cellen in de longen te bepalen, zoals dit aanzienlijk vergemakkelijken vergelijking van nieuwe biomaterialen verschillende laboratoria en instellingen. Generating consistente populaties van alveolaire macrofagen via de methodes hier beschreven, zorgen voor optimale voorwaarden voor het verkrijgen van nuttige gegevens inzake verschillende formuleringen van nanodeeltjes en hun immuunsysteem versterken potentieel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de US Army Medical Research en Materieel Command (Grant Numeri W81XWH-09-1-0386 en W81XWH-10-1-0806) bedanken voor financiële steun en Dr Shawn Rigby van de Iowa State University flowcytometrie faciliteit voor zijn deskundige technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
