Summary
Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.
Abstract
Biologisch abbaubare Nanopartikel als vielseitige Plattform für die Konzeption und Umsetzung von neuen intranasale Impfstoffe gegen respiratorische Infektionskrankheiten aufgetaucht. Insbesondere Nanopartikel Polyanhydrid aus der aliphatischen Sebacinsäure (SA), das aromatische 1,6-Bis (p-carboxyphenoxy) hexan (BER), oder die amphiphilen 1,8-Bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctan (CPTEG) haben einzigartige Masse und Oberflächenerosion Kinetik 1,2 und kann genutzt werden, um langsam freisetzen funktionelle Biomoleküle (zB Protein-Antigene, Immunglobuline, usw.) sind in vivo 3,4,5 werden. Diese Nanopartikel besitzen auch intrinsische Adjuvans-Aktivität, so dass sie eine ausgezeichnete Wahl für einen Impfstoff-Delivery-Plattform 6,7,8.
Um die Mechanismen für die Aktivierung der angeborenen Immunität nach intranasaler Schleimhaut Impfung aufzuklären, muss man beurteilen, die molekularen und zellulären Reaktionen des Antigens pübelnehmend Zellen (APC) verantwortlich für die Initiierung Immunantworten. Dendritische Zellen sind die wichtigsten APCs in leitenden Atemwege vor, während Alveolarmakrophagen (AMɸ) im Lungenparenchym 9,10,11 überwiegen. AMɸ sind hoch effizient bei der Räumung in die Lunge von mikrobiellen Krankheitserregern und Zelltrümmer 12,13. Darüber hinaus spielt dieser Zelltyp eine wertvolle Rolle bei der Beförderung von mikrobiellen Antigenen zu den Lymphknoten, die ein wichtiger erster Schritt bei der Initiation einer adaptiven Immunantwort 9 ist. AMɸ auch zum Ausdruck bringen erhöhte Werte von angeborenen Mustererkennung und Scavenger-Rezeptoren, sezernieren pro-inflammatorischen Mediatoren und prime naiven T-Zellen 12,14. Ein relativ reine Population von AMɸ (z. B. größer als 80%) kann ebenfalls in Lungenspülung für Studie im Labor erhalten werden. Wohnhaft AMɸ von immunkompetenten Tieren geerntet werden einen repräsentativen Phänotyp der Makrophagen, wird encounter die Partikel-basierten Impfstoff in vivo. Hier beschreiben wir die Protokolle verwendet werden, um Ernte und Kultur AMɸ von Mäusen zu untersuchen und die Aktivierung der Makrophagen-Phänotyp nach Behandlung mit Polyanhydrid Nanopartikel in vitro.
Protocol
1. Ernte Alveolarmakrophagen (AMɸ) aus der Maus über Lungenlavage
- Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie einen Laborkittel, Einweg-Handschuhe und entsprechende Schutzkleidung.
- Bereiten Sie komplette AMɸ (cAMɸ) Medium vor Beginn der Ernte. In 2,5 ml Penicillin / Streptomycin (Penicillin / Streptomycin)-Lösung, 250 ul β-Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol), und 25 ml Hitze-inaktiviertem fetalen Rinderserum (FBS) bis 222,25 ml Dulbelcco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM). Filter-sterilisiert cAMɸ Medium unter Verwendung eines 0,2 &mgr; m Porengröße Bottle Top-Filter unter Vakuum.
- Euthanize eine gesunde Maus durch CO 2-Erstickung in einer Nottötung Kammer. Obwohl ein C57BL / 6 Mäuse (6-8 Wochen alt) für die Zwecke des Projekts verwendet wurde, kann diese Lungenspülung Technik, auf jedem Mausstamm durchgeführt werden. Verwendung einer Druckgasflasche, können Gasstrom in die Kammer für 1 min vor dem Platzieren der Maus in der chBernstein, um sicherzustellen, dass die Kammer voll ist mit CO 2 belastet. Platzieren Sie die Maus in der Kammer für mindestens eine Minute, um die Maus einschläfern. Darüber hinaus exsanguinate jede Maus über Herzpunktion als physikalisches Verfahren zur Maus Tod bestätigen, wie unter 1.4 beschrieben.
- Lay Maus auf dem Rücken (dorsal), Spray mit 70% Ethanol, suchen Sie das Brustbein und bei einem Winkel von 30 Grad aus dem Bauch, legen Sie eine 23-Gauge-Nadel (verbunden mit einer 1 ml-Spritze) ca. 50 mm in die Brusthöhle . Bei richtiger Platzierung der Nadel, sollte es möglich sein, zwischen 0,4 und 1 ml Blut in Abhängigkeit von der Größe der Maus erhalten. Untersuchen Sie das Tier für die Einstellung der Vitalfunktionen.
- Bewegen Sie die Maus auf dem Labortisch, so dass sie sich auf den Bauch (Bauchseite) liegen. Spray-Maus mit 70% Ethanol, um die Arbeitsumgebung zu sterilisieren. Pinch Haut etwa auf halbem Weg über den Rücken der Maus. Mit Schere Dissektion, die mit 70% Ethanol sterilisiert wurden, machen einen kleinen Schnitt durch die Haut. </ Li>
- Besorgen Sie sich die Haut auf beiden Seiten des Schnittes und ziehen Sie die Haut in entgegengesetzte Richtungen entlang der Schädelbasis-caudale Achse der Maus. Wenn es richtig gemacht, wird die Haut von der darunter liegenden Kadaver entfernt werden.
- Der Hals der Maus sollte jetzt ausgesetzt Muskeln und Drüsen. Schneiden Sie vorsichtig, dass Gewebe und ziehen Sie sie in Richtung der vorderen der Maus mit einer Pinzette, wodurch der Kehlkopf, Luftröhre, Speiseröhre und der Maus. Vermeiden Sie das Schneiden der Halsschlagader oder Halsschlagader.
- Die Luftröhre ist nun sichtbar und erkennbar ist, wenn das Gewebe mit Knorpelringe um ihn herum. Fein halten die Luftröhre mit einer Pinzette und leicht anzuheben und zu trennen die Luftröhre von der Speiseröhre, die auf der dorsalen Seite befindet.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt anterior, wo man hält die Luftröhre, sondern hinter dem Kehlkopf. Der Schnitt sollte bei ca. 45 °-Grad-Winkel erfolgen. Auch nicht ganz durchschneiden die Luftröhre, wie diese wird es ab Einfahren verhindern indie Körperhöhle.
- Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit einem Kater Katheter mit sterilem PBS in Vorbereitung, um den Katheter in das Lumen der Luftröhre legen ausgerüstet. Halten Sie die Luftröhre mit einer Pinzette und mit der Hand zu halten, den Katheter in der Nähe der Spitze, um die Kontrolle zu erhöhen und schieben Sie sie vorsichtig in die Luftröhre Inzisionsstelle. Setzen Sie vorsichtig Katheter in Luftröhre etwa 20 mm. Fassen Sie die Luftröhre, die sich um den Katheterschlauch ist, die Befreiung der anderen Seite.
- Mit einer 1 ml Spritze mit dem Katheter angebracht, vorsichtig ziehen 0,75 ml Raumtemperatur, sterilem PBS in die Lunge und dann sanft saugen Sie den PBS zurück in die Spritze aufziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, während extern Massieren der Brust. Trennen Sie die Spritze aus dem Katheter und Abgeben der Spülflüssigkeit in eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Nach dem Befüllen der Spritze mit 0,75 ml frisches PBS und wieder die Spritze an den Katheter, wiederholen Sie die Schritte 1.9 und 1.10 zweimal für jede Maus. Fluidrückgewinnungssystem aber auch nur teilweise erhalten, weniger als die volume infundiert. Wenn das Sammeln Zellen, die aus mehr als einer Maus, legen Sie die 15-ml-Tube mit den geernteten Zellen auf Eis, bis alle Lungen-Lavage durchgeführt wurden.
2. Die Verarbeitung von Lungenlavage AMɸ Ernte
- Zentrifuge Lungenwasch-Flüssigkeit bei 250 xg für 10 min bei 4 ° C
- Unter Einhaltung steriler Techniken dekantieren in geeignete Abfallbehälter innerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank. Das Zellpellet durch leichtes harken das Zentrifugenröhrchen über den oberen Teil ein Reagenzglas Rack. 1 mL cAMɸ Medium, um die Zellen zu resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen mit Hilfe eines Coulter Particle Counter Z1 durch Pipettieren 20 uL von Zellen in 10 ml Isoton II Diluent im Coulter Counter Fläschchen. In 3 bis 4 Tropfen des Zap-oglobin II Lysereagenz in Fläschchen vorsichtig umdrehen 3 bis 4 mal und legen Sie das Probenfläschchen auf den Tresen, um eine Zelle Konzentration zu erhalten. Achten Sie darauf, um den Zähler mit einem Verdünnungsfaktor von 2 x 10 4 zu programmieren, um die AnzeigeZellkonzentration wie die Anzahl der Zellen pro ml.
- Verdünnte-Zellen zu 2,5 × 10 5 pro ml mit cAMɸ Medium.
- Dosiernadel 2 ml von 2,5 × 10 5 Zellen / ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatten.
- Um für AMɸ, inkubieren Kulturschalen in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2-Atmosphäre für 6 h bereichern zu lassen Zellen auf den Grund des gut haften. Den Überstand vorsichtig absaugen, um nicht zu stören anhaftenden Zellen.
- Spülen Sie die Wells mit sterilem PBS (Calcium und Magnesium kostenlos), um nicht-adhärente Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Geben Sie 2 ml cAMɸ Medium in jede Vertiefung.
- Inkubieren Zellen über Nacht in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2-Atmosphäre vor der Zugabe von Stimulanzien. Nach diesem Schritt Bereicherung, sind ca. 87% der Zellen positiv für den Makrophagen-Marker CD11b und F4/80 (Abbildung 2c).
3. Die Zugabe von Polyanhydride Nanopartikel und Kontrollbehandlungen
- Fabrizieren Nanopartikeln über Polyanhydrid Antilösungsmittel Nanoverkapselung 15. Bei diesem Verfahren wird das Polymer in Methylenchlorid gelöst (4 ° C bei einer Konzentration von 25 mg / ml) extrahiert und in Pentan (-20 ° C bei einem Verhältnis von 1:200 Methylenchlorid: Pentan).
- Abwiegen Polyanhydrid Nanopartikel mit Hilfe von sterilisierten wiegen Papier auf einer Waage, die genau messen kann Mikrogramm-Mengen. In Teilchen zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Resuspendieren Sie die Nanopartikel in eiskaltem cAMɸ. Berechnungen werden, so dass nicht mehr als 0,3 ml Medium zu jeder Vertiefung zugegeben, um die gewünschte Konzentration von Nanopartikeln zu erhalten. Halten Sie die resuspendierten Partikel auf Eis, bis die Nanopartikel zur Kultur hinzugefügt gut.
- Vor der Zugabe der Nanopartikel an die AMɸ Kulturen, beschallen Teilchen mit Hilfe eines Ultraschallgeräts Tischgerät mit einer Mikrospitze. Sterilisieren Mikrospitzen durch Besprühen mit 70% Ethanol und wiping mit einer sterilen Kimwipe vor der Beschallung. Beschallen bei 10-20 Joule für 30 bis 45 s, während die Röhrchen auf Eis. Beachten Sie Nanopartikel-Suspension makroskopisch. Wenn Teilchen nicht ausreichend dispergiert werden, damit die Suspension auf Eis für 1 bis 2 min eingestellt, um sicherzustellen, dass die Nanopartikel unterhalb der Glasübergangstemperatur des Polymers vor Beschallen wieder für 30 bis 45 Sekunden. Der Zweck dieses Beschallungsschritt ist ausreichend zu dispergieren die Nanopartikel als 50:50 CPTEG: CPH Nanopartikel neigen dazu, zusammen, wenn sie einer wässrigen Umgebung ausgesetzt. Jedoch können einige kleine Aggregate von Nanopartikeln noch in der Suspension verbleiben.
- Nanopartikel-Suspension (ausreichend dispergiert) sollten auf Eis gehalten werden und sofort verwendet werden, um ein vorzeitiges Oberflächenerosion oder Aggregation zu verhindern.
- Entfernen Sie die Kulturschalen mit dem AMɸ von Inkubator und Platz in der Biosicherheitswerkbank. Tilt Platte ungefähr in einem Winkel von 45 Grad und Pipette aus der Menge der medium aus, der der Nanopartikel-Suspension (es sollte nicht mehr als 0,3 ml) zugesetzt werden. Bitte nicht stören die adhärenten Zellen beim Entfernen des Mediums.
- Vortex Polyanhydrid der Nanopartikel-Suspension kurz vor der Zugabe zu den entsprechenden Vertiefungen. Pipettieren die Menge an Nanopartikel-Suspension (nicht mehr als 0,3 ml) in die auch spezifische (n) jedoch nicht und Abpipettieren zu mischen. Diese Aktion könnte die Anhänger AMɸ lösen aus dem Brunnen. Die Partikel werden an der Unterseite des gut einleben und an die Zellen. Für die Studien in diesem Bericht beschriebenen, war die endgültige Konzentration von Nanopartikeln mit dem AMɸ kokultiviert 125 ug / ml. Fahren Sie mit dem nachfolgenden Brunnen und gewünschte Behandlungsgruppen. Positive und negative Kontrollgruppe, wie nur Medium und 200 ng / ml Lipopolysaccharid (LPS) an bestimmte Vertiefungen.
- Senden Sie die Kulturschalen auf die 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2-Atmosphäre für 48 Stunden. Kinetische Untersuchungen in unserem laboratory 48 Stunden haben gezeigt, dass die optimale Kultur Zeitraums für die Bewertung sowohl Zell-Oberflächen-Marker-Expression und Zytokin-Sekretion, da es ausreichend Zeit erlaubt für die Transkription und Proteinsynthese stattfindet sein. Obwohl ein höheres Maß an Zytokinen während eines längeren Zeitraums Kultur (dh 72 Stunden) anfallen, kann die Bewertung Zelloberflächenmarker Ausdruck zu diesem Zeitpunkt durch den Beitrag der erhöhte Spiegel von Zytokinen verwechselt werden. Die Veränderungen der Oberfläche Marker-Expression beobachtet möglicherweise nicht direkt zurechenbaren Stimulation mit den Nanopartikeln selbst.
4. Auswerten AMɸ Aktivierung mittels Durchflusszytometrie
- Planen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Puffer (0,1% Natriumazid und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)) in 0,1 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) vor dem Ernten der plattierten Makrophagen, die mit Nanopartikeln haben o co-kultiviertr Stimulanzien.
- Planen Arbeitslösungen der Blocking-Puffer und den monoklonalen Antikörpern. Um die Blockpuffer herzustellen, zu verdünnen Ratten-IgG (Sigma) und anti-CD16/32 (eBioscience) auf 1 mg / ml und 10 mg / ml, jeweils in FACS-Puffer. Verdünnen Oberfläche Marker-Antikörper-Panel in FACS-Puffer entweder vom Hersteller empfohlenen Konzentration oder dem Benutzer optimierte Konzentration. Für die Ergebnisse in dieser Arbeit vorgestellten besteht die Oberfläche Marker-Panel von Antikörpern gegen MHC II, CD86, CD40 und CIRE (CD209). Anti-Maus-Antikörper gegen den Makrophagen-Marker F4/80 und CD11b sind auch in der Platte enthalten, um positiv zu identifizieren, der die Makrophagen-Phänotyp bei der Datenanalyse. Ist darauf zu achten bei der Auswahl der Antikörper gegen MHC II-Moleküle, wie Inzucht-Mausstämmen oft in ihren MHC-II-Haplotypen unterscheiden. Die Antikörper ausgewählt werden, müssen mit den spezifischen MHC Alloantigene von der Maus Stamm von Interesse bekundet reagieren.
- Nach 48 h Inkubation mit Nanopartikeln und / oderStimulanzien, Ort Zellkulturschalen auf Eis für 20 min. Um die adhärenten Makrophagen von den Platten entfernen, vorsichtig abkratzen Brunnen mit einem 24 cm Zellschaber.
- Mit einem 5 ml serologische Pipette vorsichtig aspirieren Zellen und Medium nach oben und unten fünf Mal, um eine einzelne Zellsuspension zu generieren. Pipettieren Sie die Inhalte der einzelnen Vertiefungen in separate 5 ml Polystyrol-Röhrchen, um nicht zu vermischen und Zellen aus verschiedenen experimentellen Behandlungen.
- 2 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen.
- Zentrifugenröhrchen von Zellen bei 250 × g bei 4 ° C für 10 min.
- Überstand dekantieren und vorsichtig resuspendieren Zellpellet in Restflüssigkeit durch Rechen die Rohre im oberen Bereich ein Reagenzglas Rack.
- Um unspezifische Bindung der monoklonalen Antikörper zu verhindern, fügen 10 l Blocking-Puffer (hergestellt in 4,2) in jedes Röhrchen von Zellen. Wirbelröhren und inkubieren auf Eis für 30 min.
- Fügen Sie entsprechende Volumen der verdünnten monoklonalen Antikörper in jedes Röhrchen und incubaß im Dunkeln auf Eis für 15 min. Rohre, die Proben enthalten, analysiert werden sollen erhalten die Kombination von Antikörpern der polycromatic Platte (früheren Optimierung der Kombination von Antikörpern sollten von den einzelnen Labors durchgeführt werden). Zusätzliche Kontrollgruppen sollten einbezogen, um korrekte Werte in die Aufnahme-Parameter am Durchflusszytometer, darunter ein Rohr von Zellen, die nicht gekennzeichnet wurden, und Schläuche, die zum Ausgleich markierten Zellen unter Verwendung jedes einzelnen Farbe separat zu entsprechen. Um richtig eingestellt die Tore für die durchflusszytometrische Analyse, die Fluoreszenz Minus One (FMO) Kontrollen sollten während der Erfassung einbezogen werden. FMO Kontrollen sind Zellen, die mit allen Fluorochrom-konjugierten Antikörper, die auf der Platte bis auf eine, die von ihren Isotyp-Kontrolle ersetzt werden markiert. Positive und negative Populationen (dh, unabhängig Aliquots von Zellen mit einer positiven Kontrolle Stimulans und Medium allein behandelt wurden) sollten auch in FMO und Entschädigung Kontrollröhrchen einbezogen werden.
- Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren Zellpellet in Restflüssigkeit durch Harken die Röhren über die Oberseite eines Reagenzglasständer.
- Wenn der Antikörper-Panel besteht aus einem Antikörper nicht direkt an ein Fluorochrom konjugiert sondern ist an Biotin konjugiert, wird ein Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin erforderlich, um die Oberflächen-Marker zu visualisieren. In diesem Schritt fügen Sie eine entsprechende Volumen des verdünnten Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin und Inkubation im Dunkeln für 15 Minuten auf Eis. Wie in 4.2 wird die Streptavidin in einer Konzentration vom Hersteller empfohlen oder einem durch den Benutzer optimiert verdünnt werden. Dieser Schritt ist nur für Platten, die biotinylierte Primärantikörper benötigt.
- Führen Sie ein Waschschritt wie in 4.10 beschrieben.
- Verdünnen Sie ein entsprechendes Volumen von BD Stabilisierung Fixativ 1:3 in entionisiertem Wasser. Je 100 ul verdünnte Fixativ in jedes Röhrchen, während sanft vortexing Verklumpen zu verhindern von Zellen. Markierte und fixierten Zellen kann stabil in der Dunkelheit bei 4 ° C für etwa eine Woche vor der Übernahme mit einem Durchflusszytometer.
5. Repräsentative Daten
Nanopartikel in Schritt 3.1 hergestellt hatten einen mittleren Durchmesser von 163 ± 24 nm und eine Morphologie mit dem von früheren Studien 5,16 erhalten. Nanopartikel in Lösung vor und nach der Beschallung sind in 1 gezeigt, um die Notwendigkeit für die Beschallung zeigen, um eine angemessene Verteilung der Partikel zu gewährleisten. Die durchflusszytometrische Analyse der geernteten AMɸs über Lungenlavage erhalten wird, in Abbildung 2 dargestellt. Markieren von Zellen mit einer Kombination von Anti-Maus-CD11b und anti-Maus-Antikörper F4/80 sowie die entsprechenden FMO Steuerelemente können zum Herstellen Hintergrundmarkierung, Identifizieren AMɸs und Gating für die weitere Analyse. Die Behandlung von Alveolarmakrophagen mit PolyanhydridNanopartikel erhöht Aktivierung durch die erhöhte mittlere Fluoreszenzintensität von MHC II, CD40, CD86 und CIRE (Abbildung 3).
. Abbildung 1 50:50 CPTEG: CPH-Nanopartikel vor (a) und nach (B) 30 s Beschallung.
2. Die durchflusszytometrische Analyse geerntet alveolären Makrophagen, die mit (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b und der PE-Cy7 FMO Kontrolle, (B) Alexa Fluor 700 FMO sowie der PE-Cy7 anti-F4/80 markiert und (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b-und PE-Cy7 anti-F4/80. Die Zahl in der oberen rechten Ecke stellt den Prozentsatz der doppelt-positiven Zellen.
3. Histogramme zeigen eine Zunahme der Fluoreszenz Absichtensität für die Oberflächenexpression von MHC-II (A), CD40 (B), CD86 (C) und CIRE (D) nach Co-Kultur von alveolaren Makrophagen mit 50:50 CPTEG: CPH Polyanhydrid Nanopartikel für 48 Stunden. Histogramme zeigen Ergebnisse für AMɸ als FMO Kontrollen beschriftet ( 
), Unbehandelt AMɸ beschriftet mit Antikörpern gegen alle Zelloberflächenmarker ( 
) Und AMɸ kultiviert mit Nanopartikeln und beschriftet mit Antikörpern gegen alle Zelloberflächenmarker ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyanhydrid Nanopartikel-Impfstoff-Plattformen haben die Wirksamkeit gezeigt, wenn intranasal in einzelnen Dosierungen 5 verwaltet. Messung der Aktivierung der ansässigen phagozytischen Zellpopulationen in der Lunge durch diesen Impfstoff induziert Delivery-Plattform ermöglicht eine Bewertung der potenziellen Fähigkeit, letztlich in der adaptiven Immunantwort.
Insbesondere Ernte Alveolarmakrophagen aus Lungenlavage und behandelt sie mit verschiedenen Formulierungen der Nanopartikel gibt Einblicke in die Fähigkeiten der verschiedenen-Partikeln zu Makrophagen aktivieren, was zu einer Antigen-Präsentation 6,8. Darüber hinaus sind diese in vitro Studien für die Beurteilung der Fähigkeit dieser teilchenförmigen Hilfsstoff Formulierungen Alveolarmakrophagen vor der Abfahrt zu aktivieren auf größere und komplexere in vivo-Studien. Experimente sollte immer eine positive Kontrolle Behandlung für Tensidee Marker up-Regulierung, wie LPS, ein Agonist des Toll-like Rezeptor 4. Vorsicht ist bei der Planung von Experimenten vor der Ernte Alveolarmakrophagen da dieses Protokoll nicht produzieren kann eine ausreichende Anzahl von Zellen für mehrere Behandlungen in einem Experiment benötigt genommen werden. Lung Spülungen muss daher unter Umständen auf mehreren Mäusen durchgeführt werden, um ausreichende Zellzahlen (~ 5,0 x 10 5 Zellen pro Maus) für größere Experimente mit mehr Behandlungsgruppen zu gewährleisten. Lungenspülung Techniken auch auf andere Arten berichtet worden, und die Menge an Fluid verwendet wird, ist proportional zu den Arten untersucht (dh Maus Lungenkapazität beträgt 1 ml ist Rattenlunge Kapazität 10 ml und menschlichen Lunge Kapazität von 6 L 17.
Polyanhydrid Nanopartikel formuliert und in einer trockenen Pulverform, um eine vorzeitige Oberflächenerosion verhindern. Aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkungen, die zu Verklumpen der Teilchen, Ultraschallbehandlung notwendig ist vor der Zugabe zu Zellkulturen. Diese sTEP ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung und führt zu besser reproduzierbaren Ergebnissen. Die Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern auf Alveolarmakrophagen mittels Durchflusszytometrie wird durch starke Autofluoreszenzsignale kompliziert. Dieses Hindernis kann durch die Optimierung der FACS-Antikörper-Konzentrationen, polychromatischen Fluorochrom-Kombinationen, und Durchflusszytometrie-Capture-Parameter (dh Einsatz von Ersatz-Kontrollen) überwunden werden. FMO Steuerung ermöglicht die Änderung eines fluoreszierenden Parameter zu einer Zeit, sind für die Einstellung Gatter für jeden Antikörper nützlich und ermöglicht die korrekte Quantifizierung der Zelloberflächenmarker Expression. Unterschiede in den Stämmen von Mäusen auch bei der Auswahl von Antikörpern, insbesondere Haplotyp Spezifität von MHC-II in Betracht gezogen werden.
Es ist wichtig, normierter Verfahren zur Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen in der Lunge zu bestimmen, da dies erheblich erleichtern wird Vergleiche von neuartigen Biomaterialien in verschiedenen Labors und Einrichtungen. Generating konsistente Populationen von Alveolarmakrophagen durch die hier vorgestellten Methoden, bieten optimale Bedingungen für den Erhalt von Nutzdaten über verschiedene Formulierungen von Nanopartikeln und deren Immunsystem stärken Potenzial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich an die US Army Medical Research und Materiel Command (Grant Numbers W81XWH-09-1 bis 0386 und W81XWH-10-1-0806) für die finanzielle Unterstützung und danken Dr. Shawn Rigby von der Iowa State University Durchflusszytometrie Facility for seine kompetente technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
