Summary
Seksuele kruisen en isolatie van recombinante nakomelingen zijn belangrijke onderzoeksinstrumenten voor de filamenteuze schimmel,
Abstract
Fusarium graminearum is uitgegroeid tot een modelsysteem voor studies in de ontwikkeling en pathogeniteit van filamenteuze schimmels. F. graminearum gemakkelijkst produceert vruchtlichamen genoemd perithecia op wortel agar. Perithecia bevatten talloze soorten weefsel, geproduceerd in specifieke fasen van perithecium ontwikkeling. Deze bevatten (in volgorde van verschijning) vorming van de perithecium initialen (die aanleiding geven tot de ascogenous hyfen), de buitenwand paraphysen (steriele mycelia waar het centrum van de perithecium bezetten tot asci ontwikkelen), de ASCI en ascosporen in de ASCI 14. De ontwikkeling van elk van deze weefsels wordt gescheiden door ongeveer 24 uur en is de basis geweest van transcriptoom studies tijdens de seksuele ontwikkeling van 12,8. Raadpleeg de Hallen et al.. (2007) voor een meer uitgebreide beschrijving van de ontwikkeling, inclusief foto's van elke fase. Hier we de werkwijzen voor het genereren en het oogsten synchronely het ontwikkelen van grasvelden van perithecia voor tijdelijke studies van genregulatie, ontwikkeling en fysiologische processen. Hoewel deze werkwijzen worden specifiek geschreven worden gebruikt F. graminearum kan de technieken worden gebruikt voor diverse andere schimmels, mits vruchtlichamen kan worden versterkt cultuur er een synchroon voor ontwikkeling. We hebben onlangs aangepast dit protocol om de seksuele ontwikkeling van F. te bestuderen verticillioides. Hoewel individuele perithecia moet de hand worden geplukt in deze soort, omdat een gazon van het ontwikkelen van perithecia kon niet worden opgewekt, is het proces werkte goed voor het bestuderen van ontwikkeling (Sikhakolli en Trail, niet gepubliceerd).
De belangrijkste functie van de schimmel vruchtlichamen is de verspreiding van de sporen. In vele soorten Ascomycota (ASCUS producerende schimmels) worden sporen Schot ASCUS door het genereren van turgor in de ASCUS, rijden uitwerpen van sporen (en epiplasmic vloeistof) door deporie in de ASCUS tip 2,7. Onze studies van gedwongen ascospore ontslag hebben geleid tot de ontwikkeling van een 'spore ontlading test ", die we gebruiken om te screenen op mutaties in het proces. Hier dienen de details van deze test.
F. graminearum is homothallic en kan dus vruchtlichamen vormen in afwezigheid van een compatibel partner. Het voordeel van homothallism dat kruising is niet nodig nakomelingen homozygoot voor een bepaalde eigenschap een facet de studie van seksuele ontwikkeling vergemakkelijkt deze soort 14,7 genereren. Echter heterothallic stammen gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor kruising 5,9. Het is ook mogelijk om homothallic stammen steken om mutanten verkrijgen meerdere genen in een stam 1. Dit wordt gedaan door coinoculating een petrischaal met 2 stammen. Langs de meeting point, zal de meerderheid van perithecia zijn recombinant (op voorwaarde dat een mutatie in een van de ouders stammen heeft geen remmend effectuitkruising). Als perithecia leeftijd, ademen ze ascosporen massaal in plaats van met geweld te lozen. De resulterende spore exsudaat (een zogenaamde cirrhus) zit op het puntje van de perithecium en kan gemakkelijk verwijderd worden voor het herstel van de individuele sporen. Hier presenteren we een protocol bij de identificatie van recombinant perithecia en het herstel van recombinante nakomelingen te vergemakkelijken.
Protocol
1. Het produceren van Perithecia
- Center inoculatie wortel agar 10 in een 6,0 cm diam petrischaal met een vruchtbare stam van F. graminearum (aanbevolen PH-1).
- Plaats geënte schalen onder felle tl-verlichting bij kamertemperatuur (18-24 ° C) en laat ze groeien tot mycelium heeft bereikt de buitenste rand van de petrischaal (3-5 dagen). Commerciële huishoudelijke tl-lampen werken prima voor het stimuleren van vruchtlichaam vorming en afscheiding.
- Verwijder de antenne mycelia met een steriele tandenstoker.
- Verdeel 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq aan de oppervlakte met een steriele glazen hockeystick of afgeronde einde van een steriele glazen staaf.
- Terug platen aan het licht. Voeg geen Parafilm aan platen.
- Na 24 uur dient het oppervlak van de platen hebben een glanzend uiterlijk. Als mycelia opnieuw verschijnt, schraap het oppervlak en breng Tween-60 oplossing.
- Let op de ontwikkeling van perithecia in de komende week. De stadia tijdens hetperithecium ontwikkeling kan worden geoogst door zachtjes te schrapen het oppervlak van de agar en flash bevroren RNA-extractie (figuur 1).
- Oudere sporen zullen zich ophopen op het deksel van de plaat op dag 7. In eerste instantie zullen deze alleen zichtbaar onder een stereomicroscoop, maar door dag 9, zullen ze hebben verzameld om een voldoende dichtheid, zodat zij met het blote oog.
2. Ascospore Discharge Assay
- Op dag 6 na het aanbrengen van Tween oplossing, snijd een 1 cm diameter cirkel uit de agar met een houten boor. Als alternatief kan een scalpel worden gebruikt om een vergelijkbare grootte segment verwijderen. De cirkel gesneden worden in half en elke halve op een microscoopglaasje.
- Plaats de stukken zodat het oppervlak met de vruchtlichamen loodrecht op het oppervlak van de schuif en de sporen afgevuurd de lengte van de schuif.
- Plaats de dia in een vochtige kamer 's nachts onder lampen. Sporen zullen zich ophopen opde dia en zichtbaar voor het blote oog de volgende ochtend (figuur 2).
- Cumulatieve sporen kan worden gewassen van de dia met water en gekwantificeerd indien gewenst.
- Mogelijke ascospore afvoer remmers kan worden getest door ze aan de achterzijde van de agar blok tijdens montage van de test. Sommige ionkanaal-remmers die de lozingen te beperken zijn eerder getest met deze techniek 15.
3. Generatie van Recombinant Progeny
- Start over te steken door het enten wortel agar met twee stammen van F. graminearum (een Nit + en een neet-), waarbij de inoculatie punten aan weerszijden van de petrischaal.
- Zodra hyfen hebben het oppervlak gevuld afschrapen antenne gedeelte en toepassing Tween-60 oplossing zoals hierboven beschreven. Gebruik marker vast aan de zijde van de petrischaal waar de hyfen voldoen.
- Keer terug culturen aan het licht en incubeer tot perithecia hebben ontwikkeld, en cirrhi hebben zijnpistool te vormen van de perithecia langs de kruising tussen de twee culturen.
- Onder de microscoop ontleden, te brengen in de perithecia te bekijken langs de kruising van de twee culturen. Met behulp van een insect pin, gesteriliseerd en gedompeld in steriel water, een cirrhus lichtjes aan te raken langs deze grens met de punt van de pen. Het vocht op de pin moet het mogelijk maken de cirrhus vast te houden aan de pin.
- Spoel het uiteinde van de pen met cirrhus op het in 200 pi steriel water in een eppendorfbuisje de sporen wassen.
- Verhit de pin, opnieuw bevochtigen en kies een andere cirrhus. Extra 10-15 cirrhi en plaats elk in een afzonderlijke buis water.
- In het kort vortexbuizen met zwevende cirrhi.
- Verwijder 60 pi van de sporesuspensie met een pipet plaats op MMT medium een in een 9cm petrischaal. Verdeel met een steriel hockeystick. De resterende sporensuspensie worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week en opnieuw geplaat indien nodig.
- Incubatorte bij kamertemperatuur (licht niet noodzakelijk) gedurende 3-5 dagen tot zeer kleine kolonies verschijnen (figuur 3). Er zullen twee soorten fenotypes bij de kolonies. De NIT-koloniën zullen schaarser hyfen dan de Nit + koloniën. Cirrhi van recombinante perithecia zal zowel kolonie fenotypes in ongeveer gelijke verhouding. Gooi de platen met kolonies slechts een fenotype daarop. Merk op dat soms meer dan twee fenotypes leiden door segregatie van andere factoren.
- Ga kolonies op V8 of wortel agar voor opslag. Test kolonies op Dox Agar Czapek (de NIT-stammen zullen niet groeien op Czapek's Dox) en op de pda met Chloraat (0,5 M Kalium Chloraat, de Nit + stammen zullen niet groeien op de pda met Chloraat) om de juiste fenotype te bevestigen. Controleer deze kolonies voor de gewenste kwaliteiten.
4. Representatieve resultaten
Het produceren van perithecia
Het doel is om een gazon vanperithecia zonder mycelia of sporen duidelijk. Het oppervlak van de cultuur zal lijken op zwart fluweel (figuur 1). Bij 24 uur na het aanbrengen van Tween het oppervlak van de agar moet een lichte glans. Als mycelia weer verschijnen, dan is de plaat mag niet genoeg zijn geschraapt om perithecium ontwikkeling te induceren.
Ascospore ontslag
Zorg altijd voor in uw test een aantal blokken van agar van de wild-type stam. Als u hier geen brand, dan is ofwel uw perithecia zijn te jong of te oud. Als ze te oud zijn, dan is een groot aantal hyfen zal verschijnen over het oppervlak van de cultuur waardoor het een witte tint. Indien dit niet het geval is, kan zij te jong de test opnieuw moet worden beproefd in 24 uur. Af en toe een cultuur heeft geen goed ontladen, en het experiment zal moeten worden herhaald. Zorg ervoor dat u de test onder de juiste lichtomstandigheden.
Recombinant nageslacht
Figuur 1. Fasen van perithecium ontwikkeling op wortel agar. Links, 72 uur na het aanbrengen van Tween. Opmerking rood pigment zeer jonge perithecia zichtbaar als een zwart korrels aan het oppervlak. Rechts, op 144 uur, hebben volwassen perithecia gevormd. Let op bijna volledige afwezigheid van oppervlakkige mycelia in beide culturen.
Figuur 2. Discharge assay. De oranje wortel agar plug is gericht zo that sporen gedwongen afgevoerd uit de rijpe perithecia op het oppervlak kan ophopen op het oppervlak van het glaasje. 15 uur accumulatie tijd.
Figuur 3. Verschillen in groei tussen Nit + en NIT-kolonies op selectieve MMT's medium. De NIT-kolonies (pijlpunten) zijn kleiner. De Nit + kolonies (pijlen) tonen een sterke groei. Foto genomen na 7 dagen.
Discussion
F. graminearum is bijzonder goed aangepast aan de studie van het vruchtlichaam ontwikkeling als gevolg van de beschikbaarheid van een goed geannoteerde genoom ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ; 4), en de beschikbaarheid van een Affymetrix- gebaseerd microarray 6. Hiermee kan het vermogen om genen die belangrijk zijn te identificeren voor ascospore ontlading 7,11,3. De methoden die hier gepresenteerd zal de onderzoeker op een discrete set van ontwikkelingsstadia en functies richten zich voor de genetische analyse van de vruchtlichamen van F. graminearum. De werkwijzen zijn ook gemakkelijk aan verwante schimmels kunnen worden geïnduceerd om fruit in cultuur en kan worden gebruikt als een standaard op tal van andere schimmelsoorten vruchtlichaam types.
De mogelijkheid om een spore afvuren fenotype te beoordelen kan subtiel zijn in soorten waar sporen zijn klein en moeilijk te zien, zoals
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (MCB-0923794 aan FT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
- Bowden, R. L., Leslie, J. F.
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
