Usando Ovos de Published: June 5, 2012 doi: 10.3791/3905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Karen L. Joyce¹, Will Morgan², Robert Greenberg², Meera G. Nair¹

¹Institute of Immunology, Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Ovos de Schistosoma mansoni são potentes estimuladores do tipo T helper 2 (Th2) resposta imunológica, característica da infecção por parasita, asma e inflamação alérgica. Este protocolo utiliza S. mansoni injecção de ovo para gerar CD4 de resposta de citocinas induzida por Th2 inflamatória no pulmão, caracterizada por formação de granuloma pulmonar em torno do ovo, eosinofilia e macrófagos activação alternativa.

Abstract

Parasitas Schistosoma são vermes de sangue que infectam cerca de 200 milhões de pessoas em todo o mundo ^1. Na infecção crónica com Schistosoma, a patologia grave, incluindo fibrose hepática e esplenomegalia, é causada pela resposta imunitária aos ovos do parasita ao invés de o próprio parasita ^2. Ovos do parasita induzir uma resposta Th2 caracterizada pela produção de IL-4, IL-5 e IL-13, a activação de macrófagos alternativa eo recrutamento de eosinófilos. Aqui, nós descrevemos injecção de ovos de Schistosoma mansoni como um modelo para examinar parasita respostas específicas de citocinas Th2 no pulmão e gânglios linfáticos de drenagem, a formação de granulomas pulmonares em torno do ovo, e inflamação das vias aéreas.

Após sensibilização intraperitoneal e desafio intravenosa, S. ovos mansoni são transportados para o pulmão através das artérias pulmonares, onde são presos no interior do parênquima pulmonarpor granulomas compostos de linfócitos, eosinófilos e macrófagos alternativamente activados ^3-6. Associadas com inflamação formação de granuloma, nos espaços bronco-alveolar, a expansão dos nodos linfáticos de drenagem e activação das células T CD4 pode ser observado. Aqui detalhamos o protocolo para o isolamento de ovos de Schistosoma mansoni a partir de fígados infectados (modificado de ^7), sensibilizando e desafiando camundongos, e recuperando os órgãos (lavado bronco-alveolar (LBA), pulmão e linfonodos de drenagem) para análise. Nós também incluir histológico dados representativos e imunológicas e sugestões para análise imunológica adicional.

Em geral, este método proporciona um modelo in vivo para investigar as respostas induzidas por helmintos imunológicas no pulmão, que é amplamente aplicável para o estudo da Th2 doenças inflamatórias, incluindo infecção helmíntica, doenças fibróticas, inflamação alérgica e asma. As vantagens deste modelo para o estudo da type inflamação 2 no pulmão incluem a reprodutibilidade de uma resposta Th2 potente inflamatória no pulmão e gânglios linfáticos de drenagem, a facilidade de avaliação da inflamação por exame histológico dos granulomas em torno do ovo, eo potencial para armazenamento a longo prazo do parasita ovos.

Protocol

1. Purificação Schistosoma mansoni Ovos

1. Infect suíça Webster-murganhos com cercarias esquistossomo, que é a fase infecciosa na vida Schistosoma ⁸ ciclo. Alternativamente, obter esquistossomo camundongos infectados a partir do NIAID Esquistossomose Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Deixar ratinhos durante 6-7 semanas após a infecção, através da qual ponto do tempo, os ovos são presente no fígado e pode ser recuperado como descrito abaixo (ver fig. 1).
2. Euthanize ratinhos com CO _2, e molhada com etanol a 70%. Coloque o mouse em volta. Use uma pinça e tesouras sem corte para cortar a pele e peritônio subjacente. O fígado Excise, localizado abaixo da caixa torácica e diafragma.
3. Finamente moída fígados e adicionar 20 mL por fígado de mistura de digestão, composto de colagenase / dispase (0,5 mg / mL), penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (100 ug / mL) em PBS. Coloque mixture num tubo Falcon 50 mL e incubar durante a noite num agitador de 37 ° C.
4. Centrifugar mistura a 400 xg / 3 min / 20 ° C. Gentilmente deitar fora o excesso de líquido e tubo de enchimento com PBS. Centrifugar novamente e repita lavagem PBS. Após centrifugação passado, ressuspender o pellet em 25 ml de PBS.
5. Coe o sedimento ressuspenso através de um padrão de cozinha metálico filtro (50 mL usar uma seringa de êmbolo para esmagar os pedaços de fígado através de, num copo de vidro), seguido pela passagem da mistura através de uma peneira fina (utilizar seringa de 10 mL para empurrar mistura através da peneira fina para um copo de vidro segundo).
6. Coloque a mistura em uma tensa tubo Falcon 50 mL. Centrifugar a 400 xg / 5 min / 20 ° C. Cuidadosamente derramar sobrenadante sem perder pelota. Ressuspender o granulado em 3 ml de PBS.
7. Sobreposição misturar suavemente sobre uma Percoll 20%, 40 mL de gradiente de 8 mL de Percoll e 32 mL de sacarose 0,25 M (FW = 342,3 assim 8,56 g sucrose/100 mL H ₂ 0).
8. Centrifugar 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipetar fora de umd descartar camada superior gelatinosa de células do fígado. Remover ovo pellet no fundo com uma pipeta de transferência e colocado num tubo Falcon 15 mL.
9. Lavagem pelete 3X em 10 mL de PBS / 1 mM EDTA / EGTA 1 mM configurações de centrífuga usando: 3 min 30 / xg / 20 ° C. Ressuspender em 500 uL de PBS.
10. Sobreposição mistura sobre uma nova Percoll 25%, 10 mL de gradiente (2,5 mL de Percoll e 7,5 mL 0,25 M de sacarose), utilizando as definições de centrífuga: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
11. Lavar 3 vezes em 10 mL de PBS com configurações de centrífuga: 3 min 30 / xg / 20 ° C.
12. Na última lavagem de 10 mL, remover 100 uL para contagem de ovos. Ovos resolver rapidamente, de modo que o tubo Falcon deve ser bem misturada antes de remover amostra. Dilui-se a amostra de 100 uL com 900 uL de PBS. 100 L da mistura deve ser contado como gotas sobre uma lâmina de microscópio utilizando um microscópio de dissecação (1:10 diluição). Dicas de grande calibre da pipeta deve ser usado.
13. Ressuspender ovos em 50.000 ovos / ml em PBS. Os ovos podem ser armazenados durante vários meses à temperatura de -80 ° C e descongelado uma vez ou TWICe para o uso. Antes da utilização, inspeccionar sob um microscópio para garantir que os ovos são ainda intacta (ver fig. 1).

2. Sensibilização intraperitoneal com S. Ovos mansoni: dia 0

1. Preparar ovos em 5000 eggs/100 PBS uL em um tubo de snapcap 5 mL. Para injecção, estimar ovos 50% mais que o necessário.
2. Carregar uma agulha de calibre 23 ^3/4inch e uma seringa de 1 mL com 100 uL de suspensão de ovo por ratinho. Ovos resolver, de modo agulha de carga com ovos imediatamente antes da utilização.
3. Seringa de rock para trás e para misturar os ovos antes de cada injeção, e injetar intraperitonealmente 100 uL de suspensão por mouse.

3. Retro-orbital Desafio intravenosa com S. Ovos mansoni: Dia 14

1. Prepare ovos, como acima a 5.000 uL eggs/100.
2. Anestesiar os ratos em câmara especializado com isoflurano (4%), ou por via intraperitoneal com xilazina (10 mg / kg) e cetamina (120 mg / kg). Profundidade da Anesthesia é determinada por beliscar de almofada da pata e garantir a ausência de resposta física.
3. Após carregamento da seringa de 1 ml e 23 agulha de calibre ^3/4inch com ovos, utilize uma pinça para dobrar a agulha com um ângulo de 90 ° com o bisel voltado para baixo para o ângulo. Verifique se não há bolhas de ar.
4. Coloque o mouse de um lado. Retrair pele de modo olho vai sobressair, e injectar 100 uL para os vasos por trás do globo ocular em um ângulo de 45 ° para o nariz.
5. Retirar a agulha e aplicar uma ligeira pressão para controlar o sangramento.

Todos estes procedimentos devem ser realizadas com cuidado, e ratinhos deve ser monitorizada até que eles se recuperar da anestesia. Estes protocolos foram aprovados pela Universidade da Pensilvânia Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

4. Colheita Experimental: Dia 22

1. Euthanize camundongos com CO _2.
2. Rato molhado com etanol 70%, e em lugar de volta.
3. Usando contundente forceps, segure o abdômen do rato e fazer uma pequena incisão na pele. Remova cuidadosamente a pele com uma tesoura e expor a caixa torácica e do peritônio.
4. Corte abrir o peritônio. Cortar o aorta abdominal para recuperar o sangue com uma pipeta de Pasteur. Guarde no gelo.
5. Mover o fígado para baixo para expor o diafragma. Use tesouras finas para cortar o diafragma. Cuidadosamente cortado e aberto da caixa torácica para expor o tecido pulmonar.
6. Recuperar os linfonodos parathymic que drenam o pulmão com uma pinça fina. Estes são dobrados por baixo da caixa torácica, em ambos os lados do timo ^9. Armazenar sobre gelo em 1ml meios estéreis (DMEM suplementado com 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, todos disponíveis a partir de Invitrogen).
7. Para recuperar o BAL, e inflar os pulmões para análise histológica, intubação orotraqueal deve ser realizada. Expor a traqueia, movendo as glândulas salivares para o lado, e placing pinça fina sob a traquéia. Utilizando uma tesoura fina, cortar um furo no meio da traqueia, e inserir tubagem para dentro dos pulmões. Fixe tubulação, amarrando com fio cirúrgico.
8. Anexar PBS-enchido seringa de 1 mL para a tubagem e insuflar os pulmões com 1 ml de PBS. Cuidadosamente recuperar lavagem BAL com seringa. Guarde no gelo.
9. Anexar paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS-seringa de 1 mL para a tubagem e inflar os pulmões.
10. Remova o tubo, e aperte o fio cirúrgico para evitar vazamento do PFA.
11. Dissecar cuidadosamente para fora do tecido pulmonar e colocar em um tubo Falcon de 50 ml com 5 ml PFA 4%.

5. Preparação de tecidos recuperados

1. Soro: Depois do armazenamento em gelo durante 30 min a 2 h, para o sangue coagular, o soro é recuperado a partir do sangue por centrifugação (13000 xg / 10 min / 4 ° C). O soro é armazenado a -20 ° C e pode ser usado para os testes ELISA de citocinas ou S. mansoni ovo antigénio-específica isotipo IgG ELISAs
2. Gânglios linfáticos: As suspensões de células únicas são preparados e as contagens de células usadas para avaliar a magnitude da resposta imune. Para examinar a polarização de células Th2, as células são re-estimuladas com S. mansoni antígeno de ovo por 72 horas. A coloração de citocinas Intracellar pode ser examinada por citometria de fluxo, e os sobrenadantes pode ser recuperado e armazenado a -20 ° C para o ELISA de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: As células são sedimentadas (400 xg / 5 min / 4 ° C). Fluido BAL é recuperado e armazenado a -20 ° C para análise de citocinas Th2 por ELISA. Contagens BAL células são usadas como uma leitura para a inflamação das vias aéreas. As preparações Citocentrífuga de 10.000-100.000 células (500 rpm / 5 min / 4 ° C), seguido por coloração Diffquik irá permitir a enumeração de infiltrado inflamatório ^{4, 6.} Alternativamente, as células de BAL pode ser examinada por citometria de fluxo ^6.
4. O tecido pulmonar: tecido de pulmão é stored durante a noite a 4 ° C. Tecido fixo é parafina, seccionados e montados em lâminas para análise histológica e de imunofluorescência.

6. Os resultados representativos

Este protocolo detalhes todos os passos necessários para (i) preparação purificada ovos de Schistosoma mansoni para uso in vivo (Fig. 1), (ii) sensibilizar e desafiar camundongos com estes ovos e (iii) recuperar os órgãos para exame da resposta inflamatória pulmonar. Este modelo in vivo de forma reprodutível acciona uma resposta Th2 pulmão potente inflamatória. Isto é mostrado pela inflamação das vias aéreas e eosinofilia como visualizado por contagem de células BAL e preparações Citocentrífuga (Fig. 2). H e secções coradas E-pulmonares pode ser examinada por ovo induzida por granulomas (Fig. 3a), e coloração de imunofluorescência de secções de pulmão permite a visualização de macrófagos alternativamente activados e Th2 citocina induzida por genes, tais como resistência-estanho como molécula (RELM) α (Fig. 3b). O antigénio específico CD4 resposta de citocinas Th2 é examinado por ELISAs para IL-5, IL-4 e IL-13 de antigénio-estimuladas células dos nódulos linfáticos parathymic (Fig. 4).

Figura 1 Schistosoma mansoni modelo de injeção de ovo imagens representativas dos fígados granulomatosas, característicos de altas S. mansoni de ovos-cargas e de ovos de S. mansoni são mostrados -.. Tamanho médio (L) 120 mM por (W) 50 mM.

Figura 2. S. mansoni injeção ovo leva a inflamação das vias aéreas. A. LBA número de células (x10 ⁵⁾ de ingênuos (N) ou S. mansoni (Sm) ovo camundongos injetados. * P <0,05. B. Preparação Citocentrífuga de células BAL. Mac, macrófagos; Eos, eosinófilos, linfa, linfócitos. Bar, 10 uM.

Figura 3. Visualização de granulomas pulmonares e macrófagos alternativamente ativados em torno do ovo de S. mansoni. A. Granuloma pulmonar em torno do ovo Sm (seta preta) foi visualizado em H & E seções manchadas de pulmão. B. técnica de imunofluorescência para RELMα (verde), receptor de manose (vermelho) e DAPI (azul) revela, em alternativa, macrófagos ativados (seta branca) no granuloma ao redor do autofluorescente Sm ovo (seta preta). Bar, 50 um.

Figura 4. S. mansoni ovo antigénio específico resposta de citocinas Th2. Drenagem células linfáticas parathymic nó de ratinhos ingénuos (N) ou Sm ovo injectado foram estimuladas com Sm </ Em> antigénio ovo durante 72 horas, seguido por ELISA dos sobrenadantes para IL-4, IL-5 e IL-13. Escala, ng / mL. * P <0,05.

Discussion

Aqui, um modelo empregando ovos de Schistosoma mansoni para induzir a inflamação do pulmão do tipo 2 é descrito. Características deste modelo incluem a resposta Th2 potente imunológico, inflamação das vias aéreas e formação de granuloma pulmonar. Uma vez que estes parâmetros são dependentes de respostas de células T CD4 + Th2 ^11, este é um modelo útil para investigar os efeitos da proteína deleções ou específicos de linhagem específica sobre respostas de células Th2. Aqui, as leituras iria incluir a quantificação de antigénio específicos citocinas Th2, a análise da infiltração de células nas vias aéreas, e tamanho dos granulomas pulmonares. Um parâmetro adicional que pode ser medido é ovo induzida por fibrose ^12. Este é medido através da coloração seções ovo com injeção de pulmão com tricrômico de Masson, que permite a visualização de deposição de colágeno que ocorre em torno dos vasos, as vias aéreas, e dentro do granuloma (mostrado na ^6).

Embora este protocolool emprega S. mansoni ovos, uma limitação do presente modelo é que ele não reproduz S. mansoni infecção, a qual é realizada infectando murganhos com cercarias infeccioso. No entanto, as vantagens deste modelo é a conveniência de fixação acima, e que não há risco de infecção do investigador. Após purificação, os ovos podem ser convenientemente congelado e utilizados vários meses mais tarde. Uma vez descongelada, os ovos não são infecciosas, e pode, portanto, ser manuseado mais facilmente do que os ovos vivos ou cercariae infeccioso. Ao preparar ovos para injeção, deve-se garantir que os ovos estão intactos por inspeção sob o microscópio. Para minimizar a interrupção do ovo, dicas de grande furo de pipeta e agulhas devem ser usadas ao manusear, e pipetagem de ovos somente quando necessário. Desde ovos resolver rapidamente, é também crítico para re-suspender por balanço suave antes de contar ou injetáveis.

Embora os ovos purificadas pode ser congelado, fígados infectados deve ser processadoimediatamente para a purificação bem sucedida de ovos. Uma vez que a gravidade da infecção, e do número de ovos presentes no fígado do rato são estirpe-dependente, os pontos de tempo para a recuperação de ovo e os rendimentos de ovos irá variar consoante os ratinhos utilizados. Aqui suíça-Webster fêmeas foram usados, e sacrificados em 6-7 semanas pós-infecção, para a geração de 10,000-30,000 ovos / fígado. Como uma referência útil, Cheever et al. detalhadamente os encargos de ovos no fígado em várias linhagens de camundongos ^13.

Injecção de ovo não induz a mortalidade. Entretanto, os camundongos podem sucumbir se o excesso de anestesiado, se a preparação de ovos não é lavada completamente (como detalhado no protocolo), ou se a injeção ovo causa hemorragia grave. Uma alternativa para retro-orbital de injecção é de injecção cauda veia dos ovos. Isto também resulta em uma resposta de pulmão potente ovo inflamatória induzida por ^3. Todos estes procedimentos devem ser realizadas com cuidado, e ratinhos deve ser monitorizada até que eles se recuperar da anestesia.

Em conclusão, este protocolo de injeção detalhes de S. ovos mansoni para a indução de inflamação pulmonar e respostas de células Th2, e é aplicável para o estudo da inflamação induzida por helmintos, asma, alergia e doenças fibróticas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase/Dispase		Roche Applied Science	11 097 113 001 (500mg)
Diff Quik Hema 3 Stain	Pack	Fisher Scientific Co. LLC	122-911
DMEM	Liquid	Gibco	11965
Falcon 50mL	Pack	Falcon	352070
Intramedic PE Tubing		Becton Dickinson and Co.	427410 (0.58mm)
Isoflurane		Abbot Animal Health	52600405 (250mL)
Ketamine		Fort Dodge, Animal Health	100mg/mL
Mannose receptor antibody	Biotin	AbD Serotec	MCA2235B
Metallic Strainer	Standard kitchen strainer	Target	Laurentiis
Paraformaldehyde		Electron Microsc. Sciences	15710 (16%)
Penicillin/ Streptomycin		Gibco	15070 (100x)
Percoll		GE Healthcare Biosciences	17 0891 01 (1 Liter)
RELMα antibody		Peprotech	500-P214 (50μg)
Surgical Thread		Surgical Specialties Corp.	SP118 (2.0 USP 100yds)
Syringe Needle		BD Vacutainer Lab. Med.	305143 (23g, 3/4 inch)
USA Standard Testing Sieve		W.S. Tyler, Inc.	150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100
Xylazine		Butler	20mg/mL