Summary
Obliterativ bronchiolitis er nøglen hindring for den langsigtede overlevelse af lunge transplanterede patienter og manglen på en robust præklinisk model til hinder for, at undersøge obliterativ bronchiolitis immunopatogenese. I modsætning til andre organtransplanterede, har vaskulariserede mus lungetransplantation først for nylig blevet udviklet. Her viser vi vores uafhængigt udviklet obliterativ bronchiolitis model efter murine ortotopisk enkelt lungetransplantation.
Abstract
Orthotopisk lungetransplantation i rotter blev første gang rapporteret af Asimacopoulos og kolleger i 1971 1. Dag, denne metode er godt accepteret og standardiseret ikke kun til undersøgelse af allo-afstødning, men også mellem syngene stammer til at undersøge mekanismerne af iskæmi-reperfusionsskade efter lungetransplantation. Selv om anvendelsen af rotter og andre store dyr model 2 bidraget væsentligt til opklaringen af disse undersøgelser, er omfanget af disse undersøgelser begrænses af mangel på knockout og transgene rotter. På grund af ingen effektive behandlinger til obliterativ bronchiolitis, den hyppigste årsag til dødsfald i lunge transplanterede patienter, har der været en intensiv søgen efter præ-kliniske modeller, der kopierer obliterativ bronchiolitis. Den tracheale allograft model er den mest udbredte og kan reproducere nogle af de histopatologiske træk obliterativ bronchiolitis 3. Imidlertid manglen på en intakt vasculature uden forbindelse til modtagerens ledende luftveje, og ufuldstændige patologiske funktioner i obliterativ bronchiolitis begrænser nytten af denne model 4. I modsætning til transplantation af andre faste organer, har vaskulariserede muselunge transplantationer først for nylig blevet rapporteret af Okazaki og kolleger for første gang i 2007 5. Anvendelse af de grundlæggende principper i rotte lungetransplantation, vores laboratorium indledte obliterativ bronchiolitis model ved hjælp af mindre histoinkompatible antigen murine ortotopisk single-venstre lunge transplantationer som giver mulighed for yderligere undersøgelse af obliterativ bronchiolitis immunopatogenese 6.
Protocol
1. Donor Procedure
- Alle kirurgiske procedurer blev udført under anvendelse af steril teknik. Ingen antibiotika bliver givet til både donor og modtager mus.
- Induktion af anæstesi i donormus initieres med 5% isofluran.
- Musen orotracheally intuberet med en 20-gauge intravenøst kateter og derefter placeret på en gnaver ventilator med 100% oxygen ved en hastighed på 125 vejrtrækninger / minut og cirka 0,5 ml tidal volumen (2% af sin kropsvægt).
- Anæstesi vedligeholdes med inhaleret 1-2% isofluran.
- Donoren mus anbringes i en rygliggende position, prepped med 70% alkohol.
- Laparosternotomy udføres som en kombineret midtlinie og tværgående incision.
- Heparin ved 100 U / kg injiceres i den nedre vena cava (IVC), fra lige under leveren.
- Membranen skæres langs den ventrale ribbenskurvaturen fastgørelse mod rygsøjlen, og brysthulen blotlægges ved at skære begge sider af brystetvæggen til halsen.
- Efter indskæring IVC på niveauet for membranen, er den højre atriale vedhæng udskåret og lungerne gennemskylles med 2 ml afkølet (4 ° C) lakteret Ringers injektion og 0,1 ml af heparin ved hjælp af en tværgående incision i roden af den pulmonale arterie ( PA) kuffert.
- Standsning ventilation til to tredjedele af ende-tidal inflation, er hjerte-lunge-blok udskåret og opbevaret på is (4 ° C).
- Donoren venstre lunge er forberedt til modtageren ved fastgørelse af manchetter. Den pulmonære ligament er incideret til lungevenen (PV). Den hilum føres ud ved at fjerne esophagus og aorta.
- Identificere PA, som er placeret på den mest kraniale aspekt af hilum, samt de vedføjede primære bronkier (Br). Forsigtigt dissekere PA fra bronkier.
- PA manchetten er fremstillet af et 24-gauge intravenøs (IV) kateteret og skåret til 0,5 mm i længde med en forlængelse på 0,7 mm.
- Hele overfladen af manchetten derefter slibes for at lette anastomosis.
- Manchetten for bronchus er afledt fra en 20-gauge IV kateter, og skåret i længder på 1,0 mm med en forlængelse på 0,7 mm.
- Anvendelse af de samme materialer, PV manchetten varierer med vægten af donormus. Specifikt for mus 24-27 gram manchetten størrelse er 22-gauge, 0,7 mm i længde med en 0,7 mm forlængelse. For mus, der vejede 27-32 g, anvendt undersøgelserne en 20-gauge kateter, som er 0,7 mm i længde med en 0,7 mm forlængelse.
- Manchetterne er indsat i de distale ender af PA, PV og Br og sikret med en 9-0 sutur.
- Donoren lunge skylles og vaskes med sterilt saltvand med sterilt heparin før opbevaring. Donoren lunge derefter omviklet med steril gaze gennemvædet i sterilt saltvand på is (4 ° C), der holder lungen meget rent og sterilt.
- En mikrokar klemme er placeret på bronchus at forhindre Ringers laktat ind i luftvejene.
2. Modtager Procedure
- Induktion af Anesthesia og mekanisk ventilation er de samme som beskrevet for donoren ovenfor.
- Den venstre brystvæggen barberet og præpareret med 70% alkohol og det kirurgiske område er draperet.
- En thorakotomi incision i den venstre tredjedel interkostale mellemrum, der strækker snittet dorsalt tæt på ryggen, og en mikrokar klemme anbragt på venstre pulmonale kar og bronchier tilstødende til hjertet. Man kan se PA på kraniale aspekt PV ved den caudale ende af hilum og Br mellem dem.
- Brug blide trækkraft på arterieklemme at forårsage mild spænding på PA, Br og PV, er den venstre lunge trækkes ud fra brysthulen mens de centrale hilar strukturer fastspændt.
- PA, PV og Br er isoleret ved stump dissektion efterfulgt af at placere en 9-0 sutur placeret løst rundt om PA, PV og Br.
- Efter dissekering PA fuldstændigt fra sin adventitiale kappe, en lille tværgående indsnit på ca fjerdedel af fartøjets omkreds ergjort til den forreste væg, der forlader en fortsættelse af den dorsale del af arterien intakt.
- Donor lunge, indpakket i kold, Ringers laktat-gennemblødt bomuldsgaze og fremstillet som beskrevet ovenfor, placeres derefter ind i brysthulen og manchetter indsat i recipienten PA, PV og Br og sikret med 9-0 sutur.
- Den hilar tværs klemme fjernes tillader reperfusion og ventilation.
- Efter placering af transplanterede lungen tilbage til modtageren thorax er torakotomi snittet lukkes ved hjælp af en 5-0 sutur.
- Mus får lov at komme sig fra anæstesien. Buprenorphin (0,05-0,15 mg / kg) indgives umiddelbart efter kirurgi, og i hver 8. time i 2-3 dage efter kirurgi.
3. Repræsentative resultater
Vores erfaring har lært os, at det kræver flere måneders gentagne praksis at blive dygtige i musen lungetransplantation model. Efter færdigheder er opnået, har vi enchieved en 96% (96/100 på hinanden følgende operationer) perioperativ overlevelsen med dødsfald inden for syv dage efter operationen. To dødsfald skyldtes blødning, som begyndte intraoperativt, og pneumothraces var årsag til dødsfald i de to andre mus. For alle procedurer var varm iskæmi tiden 14,32 ± 3,14 minutter og koldt iskæmi tid var 58,51 ± 18.06 minutter. Tre orthotopisk lungetransplantation grupper blev undersøgt: isotransplantat: C57BL / 6 → C57BL / 6, allograft: C57BL/10 → C57BL / 6 og C57BL / 6 → C57BL/10. Vi brugte kun hanmus, men vores teknik kan også anvendes på hunmus, fordi der ikke er nogen signifikant anatomiske forskelle mellem kønnene.
Vurdering af afstødning patologi blev udført på en blindet måde under anvendelse af sædvanlige betingelser for klinisk lungetransplantation 7 (tabel 1). Hvor vi observeret mild eller ingen afvisning i isotransplantat (C57BL / 6 → C57BL / 6), begge allotransplantat kombinationer udviklet virksommindeværdige akut eller kronisk afstødning (Fig. 1). I modsætning hertil var OB langt oftere i C57BL/10 → C57BL / 6 end C57BL / 6 → C57BL/10 gruppe ved day28 (tabel 1).
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | C57BL/10 → C57BL / 6 | C57BL / 6 → C57BL/10 | P-værdi | |
| Afvisning Patologi "A" Scores på dag 28 | 0,67 ± 0,89 | * 3,33 ± 0,82 | * 3,29 ± 0,76 | * P> 0,05 |
| OB / Total mus på dag 21 og 28 | 0/24 (0%) | ** 14/34 (42,1%) | ** 2/16 (12,5%) | ** P <0,05 |
Tabel 1. Histologiske snesevis af akut afstødning og forekomsten af obliterativ bronchiolitis efter transplantationen. Scoring af akut afstødning ("A" Score) ved standard CRIterier, som beskrevet i repræsentative resultater. Data repræsenterer middelværdien ± SD af A-Resultaterne på dag 28 efter transplantation. Data repræsenterer mængden og procentdelen af mus i hver gruppe, som udviklede OB på dag 21 og 28 efter transplantationen.
Figur 1. Makroskopiske resultater og histopatologi på 28 dage efter lungetransplantation. Panel 1A repræsenterer makroskopiske fund og H & E farvede isotransplantat lunge og højre naive lunge. Panel 1B og 1C repræsenterer H & E og Massons Trichrome-farvede BL/10 lunge allograft transplanteret ind BL / 6 mus modtager, som udviklede OB og ikke OB hhv. Den hvide pil på 1B identificerer læsioner af OB. Panel 1D viser BL / 6 lunge allograft transplanteret ind BL/10 mus modtager.
Main fejlfinding i løbet af proceduren var som følger.
- Blood flow lidelse: Flush donor lunge, indtilfarven bliver hvid farve. Brug af stort tryk kan fremkalde lungeødem. Men du behøver ikke skubbe alt for meget for at forebygge ødem efter transplantation.
- Vanskeligheden manchet indføring i donoren: sikres at vaskulatur er af tilstrækkelig længde og fri for vedhængende fedt og bindevæv.
- Blødning på anastomotiske sted: Brug Q tips til at lægge pres på angrebne sted for cirka 5 minutter.
- Modtager PA blodgennemstrømning obstruktion: Primært forårsaget af vridning af under manchetten indsættelsen. Hvis luften er observeret inden PA derefter igen gør den anastomose er nødvendig.
- Svært PV anastomose: Membran af PV er meget tynd og let tårer. Vælg passende størrelse manchet og indsætte direkte til modtagerens PV meget forsigtigt.
- Modtager PV blodgennemstrømning obstruktion: Sørg for, at position og retning af manchetten. Slip kompression fra bronchiale manchetten.
- Pneumothorax: Dette kan skyldes enten bronchial perforering grund manipulation af luftvejene eller perforering af lungeoverfladen på grund af traume associeret med transplantation. Førstnævnte behandles med kirurgisk lukning af hullet i luftvejens væg, og denne behandles ved oversewing lækagen på lungeoverfladen hjælp 10-0 nylonsutur.
Discussion
Orthotopisk lunge transplantation i mus er udfordrende på grund af mikrokirurgiske krav og ekstreme skrøbelighed væv. Indførelse af manchetten teknik har gjort det muligt for den udbredte brug af ortotopisk lungetransplantation i rotter 8. Dette blev grundlaget for udviklingen af orthotopisk lungetransplantation model i mus i vores laboratorium. Hos mus og rotter, i modsætning til mennesker venstre lunge kun indeholder en lap og udgør kun 25% af den samlede lungekapacitet masse. Dette gør venstre enkelt lungetransplantation muligt i den murine model uden behov for en cirkulationen system.
Vores indledende kirurgi viste, at ventilation og perfusion af transplanterede lungen var meget afhængig af størrelsen af PV anastomose. Specifik PV anastomotisk manchet størrelse blev anvendt til at matche donor og modtager som rapporteret 9. Uhensigtsmæssig manchet dimensionering resulterede i enten atelektase af det transplanterede lunge eller opspringning af PV anastomosis. Okazaki et al rapporterede brug af kombineret skib ligeringen og klipning af bronkier 5. I den aktuelle undersøgelse bruger vi en aneurisme clips for alle hilar strukturer, som vi foreslår kan forkorte varme iskæmisk tid. En begrænsning af orthotopisk venstre lungetransplantation i den murine model er, at recipientdyr kan overleve efter alloimmun-medieret nekrose af deres allotransplantater 5. Derfor overlevelsesundersøgelser ikke er mulig og graft vurdering afhænger histologisk undersøgelse af det transplanterede lungen 10.
Ved hjælp af denne teknik, har vi udviklet en præklinisk obliterativ bronchiolitis model i mus. Konkret donor musen er C57BL/10, og modtageren er C57BL / 6. Dette tyder rolle mindre, og ikke store, histokompatibilitetsantigener i obliterativ bronchiolitis patogenese 6. Desuden har vi rapporteret at neutralisere IL-17 forhindrer obliterativ bronchiolitis i den murine model. Denne tilstandl repræsenterer en ny forskning værktøj til undersøgelse af lunge transplantation og fremme af kliniske lungetransplantationer.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Finansieringskilder: dette arbejde, som støttes af National Institutes of Health tilskud HL067177 og HL096845 og P01AI084853 at DSW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Opmi 6SFC-1880 | Prescott’s Inc | PMZ014 | |
| Harvard Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7058 | |
| 20-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100510D | |
| 22-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 081015S | |
| 24-gauge I.V. catheter | Terumo Medical Corporation | 100522A | |
| 9/0 Meth Blue Virgin Silk | Ashaway Line Twine Mfg. CO | MBVS-90 | |
| 10-0 Alcon Surgical Suture | Alcon Laboratories, Inc | 8065-192101 | |
| Black Braided Silk 5-0/18inches | Henry Schein | M652630 | |
| Heparin Sodium 1000 units/ml | APP Pharmaceuticals | 407156 | |
| Betadine Solution | Purdue Product | 67618-150 | |
| Lactated Ringer's injection | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| C57BL/10 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor |
| C57BL/6 | Harlan Sprague-Dawley | 8-12 weeks, 25-30g | Male, Donor or recipient |
Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment. |
|||
References
- Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
- Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
- McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
- Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
- Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
- Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
- Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
- Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).
