Summary
Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação
Abstract
Isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicado em uma grande variedade de condições patológicas tais como acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, isquemia intestinal, assim como após o transplante, e cirurgia cardiovascular. 1 reperfusão do tecido isquémico anteriormente, enquanto essencial para a prevenção de irreversível lesão tecidual, elicia inflamação excessiva do tecido afectado. Adjacente à produção de espécies reactivas de oxigénio, activação do sistema do complemento e aumento da permeabilidade microvascular, a activação de leucócitos é um dos agentes princípio na cascata patológico do dano tecidual inflamatória durante a reperfusão. 2, 3 activação dos leucócitos é um processo em várias etapas consistindo de laminagem, adesão firme e transmigração e é mediada por uma interacção complexa entre moléculas de adesão, em resposta a chemoattractants tais como factores do complemento, quimiocinas, ou factor de activação de plaquetas. 4
<p = classe "jove_content"> Enquanto circulante de leucócitos em vénulas pós-capilares é predominantemente mediado pela interacção das selectinas 5 com os seus ligandos de balcão, adesão firme dos leucócitos ao endotélio é-selectina controlada através da ligação a moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular As moléculas de adesão (VCAM). 6, 7Padrão-ouro para a observação em vivo de leucócito-endotelial interação é a técnica de microscopia intravital, descrita pela primeira vez em 1968 8.
Embora vários modelos de IRI (isquemia-reperfusão) têm sido descritos para vários órgãos, 9-12 apenas poucos são adequados para a visualização directa do recrutamento de leucócitos no leito microvascular em um elevado nível de qualidade de imagem. 8
Nós aqui promover a microscopia de epifluorescência intravital digitais da vênula postcapillary na microcirculação cremastéricodo rato 13 como um método conveniente para qualitativamente e quantitativamente analisar o recrutamento de leucócitos para a pesquisa IRI-no tecido do músculo estriado e fornecer um manual detalhado para a realização da técnica. Nós ilustrar ainda mais as armadilhas comuns e fornecer dicas úteis que deverão permitir ao leitor a apreciar verdadeiramente, e executar com segurança o método.
Em um passo a passo protocolo que descrevem como começar com anestesia respiração controlada sob monitorização suficiente para manter o animal anestesiado com firmeza por longos períodos de tempo. Em seguida, descrevem a preparação cremastérico como uma folha fina e plana para a resolução óptica surpreendente e fornecer um protocolo para imagiologia de leucócitos no IRI que tem sido bem estabelecidas nos nossos laboratórios.
Protocol
1. Anestesia e Monitorização
- Apropriadas ética nacionais e institucionais devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Após a aprovação do Comitê de Ética anestesiam ratos machos Sprague Dawley com peso de 120-180 g. Entregar 2 - 3% vol isoflurano a uma caixa de acrílico através de vaporizador de isoflurano e coloque dentro de rato.
- Logo que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de reacção ao dedo do pé ou pitada cauda) no rato é pesado e raspada na área ventral cervical.
- Colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C e aplicar isoflurano em 2% vol usando uma máscara de silicone.
As etapas de preparação que se seguem são melhor realizada usando um microscópio cirúrgico.
- Para a preparação da traqueia, a artéria carótida ea veia jugular, executar uma incisão na pele 2 centímetros horizontal na área of fúrcula e mobilizar as glândulas salivares lateralmente.
- Você agora enfrentam os músculos do pescoço ventral. Com cuidado, separe-os na linha média e encontrar a traquéia. Exponha 1 - 2 cm da traquéia e coloca uma pinça micro sob ele, de modo a levantá-lo.
- Agora cortar a meio do lado ventral da traquéia. Tenha cuidado para não cortar todo o caminho, se você fizer isso, o corte final da traquéia vai escorregar de volta para o peito e ser muito difícil de trabalhar.
- Inserir um tubo Abbocath (14G), utilizado como tubo traqueal para a parte inferior da traqueia, a qual tenha sido previamente ligado a um ventilador animal. Dica: fixação firme em grampos magnéticos, bem como a sutura da traquéia ao redor do tubo é essencial para manter o tubo traqueal no local. Geralmente usamos Terylene 5/0 de sutura, o material da sutura no entanto semelhante pode ser usada.
- A respiração pode ser controlada a volume (freqüência, 35 - 45 respirações por minuto, volume corrente, 4,5 - 5 ml; FiO 2 14 Atelectasia pode ser evitada através da manutenção de um expiratória final positiva pressão de 5 a 10 mm de H2O 15
- Para a canulação da carótida, o músculo esterno-direito é separado por dissecção romba para localizar a artéria carótida.
- Separe cuidadosamente o nervo vago a partir da artéria carótida e da artéria em montar uma pinça angulada micro para parar o sangue que flui do coração.
- Passar duas peças de comprimento igual de sutura sob a artéria carótida. Em referência ao coração, a sutura mais distai está ligada firmemente para ocluir sangue que flui a partir da região da cabeça enquanto que a sutura proximal está ligado frouxamente em torno da artéria carótida.
- Utilizando uma tesoura micro um pequeno corte é feito na artéria carótida entre as duas ligaduras.
- Inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) cheio com solução salina normal, que está ligado a um transdutor de pressão.
- Remove a pinça micro e fios o cateter ainda mais para dentro da artéria. Em seguida, aperte a ligadura proximal ao redor da artéria e cateter. Dica: A aplicação de uma segunda sutura proximal impede o sangramento após a retirada da pinça micro.
- Amarre a ligadura distal ao redor da carótida eo cateter para ancoragem adicional.
- Monitorar a anestesia continuamente pela taxa de monitorização cardíaca e da pressão arterial. Realizar intermitentes análises de sangue arterial de gás utilizando um analisador de gás do sangue. 16 Uma taxa cardíaca inferior a 300 batimentos por minuto ou superior a 360 batimentos por minuto, bem como uma queda de pressão arterial média inferior a 80 mmHg durante mais de 5 minutos são critérios para exclusão. 17, 18 Manter sangue pH dentro dos limites fisiológicos (7,35 - 7,45). No caso do experimento deve ser finalizado devido a taxas anormais de monitoramento, escarificar o animal por deslocamento cervical ou exanguation.
Para a aplicação intravenosa de corantes fluorescentes ou outros fármacos óf interesse, faça o seguinte:
- Concentre a área da veia jugular esquerda com o microscópio cirúrgico.
- Com uma pinça em cada mão, rasgar a fáscia fina para revelar a veia jugular. Monte a veia em uma pinça de ângulo micro. O fluxo de sangue, então, parar.
- Usando uma pinça, duas peças de comprimento igual de sutura são passados sob a veia jugular concordante com a canulação da carótida. Amarre a sutura distal bem como a sutura proximal frouxamente em torno da veia jugular.
- Fazer um pequeno corte na veia jugular e inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) que foi lavada com solução salina. Marcar que incisão e canulação pode ser mais exigente e demorado do que a da carótida.
- Passe o cateter para o coração e apertar a ligadura mais próximo do coração em torno da veia e do cateter.
- Depois de permeabilidade conforme, amarre ligadura distal ao redor do cateter. Dica: fixação adicional de boª cateteres com fita pode impedir o deslocamento.
- Lavar cateteres com freqüência para evitar a coagulação intraluminal.
2. Preparação do músculo cremaster
- Nós usamos um estágio de alumínio de 1,5 - 2 cm de espessura para imagens cremastérico. A fase rapidamente adopta a temperatura desejada da almofada de aquecimento assim aliviando controlo térmico do tecido cremastérico. Isso é fundamental para estudos de inflamação. Alternativamente, uma plataforma de Plexiglas podem ser utilizados embora a regulação da temperatura cremastérico é mais difícil. Coloque o escroto no centro da fase.
- A incisão inicial é feita na pele e fáscia espermática externa acima do escroto no final distal seguido de dilatação cuidado com o espaço subcutâneo com uma tesoura fina. Evite tocar o tecido subjacente com os instrumentos.
- Logo que o tecido é exposto é humedecido com pré-aquecido (37 ° C) solução salina tamponada com fosfato wicálcio e magnésio th. Aplicar a solução regularmente para qualquer tecido exposto.
- O tecido conjuntivo entre a fáscia espermática externa eo músculo cremaster é cuidadosamente removida para liberar o músculo cremaster do tecido circundante.
- A superfície exterior do músculo cremaster é, então, cautelosamente limpo de tecido conectivo. Superfusão contínua durante hidratos de dissecação do tecido conjuntivo, facilitando a visibilidade e remoção.
- Suturar a extremidade distai do saco cremaster para segurar para baixo e ligeiramente estender a extremidade do saco.
- Faça uma incisão na extremidade distal do saco na face ventral e alongar a incisão proximalmente com uma tesoura micro. Cuidadosamente cauterizar vasos sangrantes ao longo das linhas de incisão utilizando um termo-cautério. Evite a cauterização desnecessária para limitar adicionais estímulos inflamatórios. Dica:. Dinâmica do fluxo sanguíneo perto da periferia da preparação são alterados por este dano tecidual 19 Portanto, para minimizar oSE afecta a recolha de dados, os vasos sanguíneos, perto do centro da preparação deve ser usado para geração de imagens.
- O cremaster aberto fica encostado ao pedestal de alumínio embora ainda ligados por um ligamento fino para o epidídimo debaixo do testículo. Refletindo o testículo de um lado expõe esse ligamento, incluindo uma pequena artéria e veia que liga ao epidídimo. Use o cautério para selar os vasos e empregar as tesouras micro para cortar o ligamento conectivo entre testículo e tecido cremastérico.
- Com cuidado, empurre de volta ao testículo isolado dentro do canal inguinal. Outros autores ressecção do testículo após a ligadura proximal (orquiectomia), juntamente com a almofada de moda associada inguinal 20. Em um modelo sensível como IRI ativação induzida leucócitos tentamos evitar todos os estímulos adicionais cirúrgicos, portanto, abster-se de ressecção do testículo, que normalmente não é necessária para obter uma exposição suficiente do músculo cremaster.
- Além da primeirasutura de fixação quatro arestas de tecido (duas de cada lado) e unem os segmentos para fitas a cautelosamente espalhar o tecido cremastérico radialmente sobre a fase de alumínio. Deixando uma lacuna entre o estágio de alumínio e entrada externa do canal inguinal simplifica recorte cremastérico subseqüente para isquemia.
- Coloque duas extremidades do cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) próximo ao tecido cremastérico para a configuração superfusão. Assegure-se que o lúmen é livre de ar para evitar bolhas de ar na câmara de fluido eventual.
- Desenhar uma linha de vaselina (vaselina) em torno do músculo cremaster usando uma seringa. A linha deve estender-se o tamanho da lâmina de cobertura que é usado para a cobertura.
- Para criar uma câmara de fluido, colocar uma lamela quadrado (32 × 32 mm) sobre o tecido cremastérico e firmemente ligar as pontas para a linha de vaselina.
- No caso de o tecido não está cremastérico superfused com uma droga específica, a substituição contínua da gripe circundanteID não é essencial. Uma única aplicação de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio para dentro da câmara criada pode então ser suficiente. Estimulação local com drogas no entanto deve ser realizada de forma contínua através de micro-perfusão bomba a uma taxa de 3 ml por hora.
- O tecido cremastérico está agora pronto para a imagem latente microscópica.
3. Configuração intravital
A configuração básica intravital pode variar. Para imagens de epifluorescência, os experimentos devem ser executados em um quarto escuro.
- O animal é transferida para o estágio de um microscópio de epifluorescência intravital equipado com um LED 470 nm fonte luminosa para epi-iluminação. Usar uma objectiva de imersão em água (20 × / 1,0) para atingir a ampliação de cerca de 800 ×. Registre as observações por meio de uma câmera de alta resolução digital e armazenar registros em um computador pessoal para avaliação off-line.
- Para a rotulagem de leucócitos, injetar rodamina6G por via intravenosa através do cateter jugular em concentrações de 0,4 peso corporal mg / kg.
- Escolha uma vênula postcapillary para observação. Tamanho do vaso deve variar entre 20-60 mM e fluxo de sangue deve ser suficiente. Para minimizar a influência da pré-activação do tecido, apenas os vasos em que rolamento de leucócitos é inferior a 20 cells/30 segundo e do número de células aderentes <10 cells/200μm de endotélio venular podem ser utilizados para análise posterior.
- Se possível, até três vénulas pós-capilares podem ser utilizados para observação, contudo eles devem estar localizado numa secção correspondente do tecido cremastérico para evitar confusão dos vasos em pontos de tempo diferentes.
4. Isquemia-reperfusão (IIR)
- Deixe tecido estabilizar durante 30 minutos.
- Realizar uma gravação de 30 segundos para estabelecer os valores basais de rolamento de leucócitos e aderência. Idealmente, gerar um total de três gravações basais para verificar celularnúmeros e para obter desvios-padrão.
- Suavemente colocar um clipe vaso Biemer em torno da extremidade proximal muito do tecido exposta cremastérico usando os fórceps de aplicação. Estase deve ocorrer imediatamente e pode ser visualizada por microscopia de epifluorescência na secção do vaso observada.
- Uma variedade de cursos de tempo podem ser utilizados dependendo do nível de prejuízo requeridos. Nós aplicamos 30 minutos de tempo de isquemia, como descrito por outros autores. 21-23 Retire o grampo navio depois. Permitir fluxo de sangue para estabilizar durante mais 15 minutos.
- Gravações subsequentes de 30 segundos de duração pode ser feita ao longo do período de reperfusão (por exemplo, 30 segundos cada 15 minutos). Guarde as gravações digitalmente para análise offline.
- Para o fim da experiência, o rato é sacrificado por deslocamento cervical, sob anestesia suficiente premindo um instrumento rombo, tais como a borda monótona de uma lâmina de tesoura na base do crânio. Com a outramão, a base da cauda é rapidamente puxado, causando a separação das vértebras cervicais a partir do crânio.
5. Análise reprodução offline Vídeo
- Para análise offline reprodução de vídeo é útil para usar o software que permite a seleção de imagens distintas e observação da seqüência de vídeo em câmera lenta. Ajuste o contraste eo brilho de forma adequada. Usamos software fornecido pelo fabricante do microscópio que permite medições de comprimento e de ampliação digital.
- Para a quantificação do rolamento de leucócitos, definem uma linha virtual que intersecta o vaso verticalmente que é consistente em todos os registos. Contar o número de leucócitos de rolamento que passam a linha dentro de 30 segundos manualmente.
- Para a quantificação dos leucócitos aderentes, definem uma secção do vaso 200 iM que é consistente em todos os registos 23 Contar o número de leucócitos claramente visíveis que permanecem estática durante 30 segundos -. Assim definidoresed como aderentes 24.
6. Os resultados representativos
IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), a frequência cardíaca eo pH do sangue
Utilizando a configuração acima mencionada (Figura 1), foi investigada a microcirculação em IRI ao longo de um protocolo de duas horas, no entanto um tempo de observação muito mais tempo até 6 horas é possível. Como mostrado na Figura 2, o IRI do músculo cremaster não tem efeitos significativos sobre a circulação macrohemodynamic rato como a pressão arterial média e da frequência cardíaca permanecer estável durante todo o período de investigação. Além disso, monitoramos homeostase por meio de medições freqüentes do pH do sangue arterial, que variaram dentro dos limites fisiológicos e não mostrou significativas entre grupos de diferenças.
IRI induz rolamento de leucócitos na circulação cremastérico
Interação endotelial de leucócitos é uma chaveevento na inflamação aguda. Por meio de microscopia intravital foi observado um aumento dependente do tempo no número de leucócitos de rolamento em IRI do músculo cremaster (Figura 3A) concordantes com os dados anteriores 21, 25. Rolamento montado sobre o tempo de observação de duas horas para um máximo de 137,63 ± 22,55% do valor de linha de base após 120 minutos de tempo de reperfusão e, em seguida, atingiram significância estatística em comparação com animais operação simulada (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% do valor de linha de base).
IRI induz a adesão de leucócitos na circulação cremastérico
Para a avaliação adicional de leucócito-endotelial interacção analisamos a adesão de leucócitos em uma secção do vaso 200 uM. IRI induziu um aumento no número de leucócitos aderentes que excedeu significativamente os valores de operação simulada animais após 60 minutos (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% do valor de linha de base) e ainda mais ASCEnded por 120 minutos de reperfusão (Figura 3B).
Em resumo, o descrito no modelo in vivo fornece dados consistentes de ativação leucocitária aguda em IRI sobrevivência animal, enquanto a circulação ea estabilidade é garantida.
Figura 1. A. Fluxograma para o desempenho de microscopia de epifluorescência intravital na isquemia-reperfusão do músculo cremaster de rato. Após os preparativos necessários para anestesia e monitoramento, o músculo cremaster de rato é exposto para a imagem latente. Registros de ativação leucocitária são tomadas antes e depois da isquemia tecidual. Análise de vídeo subsequente é melhor executada offline. B. Figura esquemática da configuração proposta intravital. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), ritmo cardíaco e pH do sangue. A pressão arterial média (A) e da frequência cardíaca (B) foram monitorizados a cada 30 minutos durante toda a experiência através de transdutor de pressão após canulação da direita da artéria carótida. A medição do pH do sangue arterial-(C) foi realizada após 0, 60 e 120 minutos. Valores são média ± EPM de 6 animais diferentes, variando em níveis fisiológicos, sem diferenças significativas inter-grupos. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. IRI aumenta leucócitos-Endotelial interacção na circulação cremastérico. Após marcação de leucócitos com rodamina 6G (0,4 peso corporal mg / kg) microscopia de epifluorescência intravital foi utilizado para determinar leucócito-endotelial de interacção em lesão de reperfusão através de um protocolo minutos 120 após 30 minutos de isquemia de tecido. Registos foram tomadas a ampliação de cerca de 800 ×. A. IRI aumenta significativamente o número de leucócitos de rolamento em vénulas pós-capilares do músculo cremaster por 120 minutos de reperfusão Considerando rolamento de leucócitos permanece estável ao longo da experiência no tecido cremastérico que não foi submetido a isquemia. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P <0,05 utilizando o teste t não emparelhado. B. O número de leucócitos aderentes é significativamente aumentada em uma secção do vaso escolhido aleatoriamente 200μm postcapillary após 30 minutos de isquemia cremastérico e subsequentes 60 minutos de reperfusão do tecido. Resultados ficar ainda more pronunciado após um período de reperfusão de duas horas. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P <0,05 utilizando o teste t não pareado. Imagens representativas C. de uma vênula postcapillary antes da isquemia (esquerda) e 120 minutos após o IRI (direita). Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Leucócito-endotelial interacção, a produção de espécies reactivas de oxigénio e de activação do sistema do complemento são as principais características de IRI induzida por disfunção do tecido. 26 microcirculação A do tecido afectado é considerado como o local integral para o início inflamatória. Para além de experimentações ex vivo, tais como ensaios de câmara de fluxo 27, 28, é obrigatória a existência de modelos bem-estabelecidos de imagem intravital para avaliar melhor a relevância in vivo. Embora IRI tem sido implicado em vários sistemas de órgãos, nós aqui descrever um método para analisar sistematicamente leucócito-endotelial de interacção em lesão de reperfusão do tecido do músculo estriado que foi primeiro descrito por Baez et al 13, portanto, particularmente relevante em cirurgia de retalho (Figura 1). 29 Como é assumido que o pós-isquémica lesão tecidual de outros órgãos envolve os mesmos mecanismos inflamatórios, o modelo descrito pode ser usado para gain percepções princípio em mecanismos fisiopatológicos da IRI, relevantes em doenças como enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral ou isquemia intestinal.
Os animais utilizados
O modelo aqui apresentado é adequado para a maioria dos roedores, incluindo ratos e camundongos. Para o longo período de imagem que é necessário neste modelo que geralmente preferem ratos como traqueotomia e volume de respiração controlada pode ser facilmente realizados. Em combinação com a imagem cardiovascular através canulação arterial, os ratos podem ser mantidos circulatório e homeostaticamente estável para horas (Figura 2). Além disso tecido cremastérico é mais extensa do que em ratos é em ratinhos que saem mais opções para imagiologia postcapillary. Embora a preparação do tecido pode ser mais fácil executada em ratos lager, deve-se considerar que o tecido cremastérico e especialmente a fáscia cremastérico é mais fino em ratos jovens (100 -150 g), reduzindo assim a fluorescência de fundo e sobreposição de addititecido fascial onal. No entanto uma vantagem da utilização de ratinhos para microscopia intravital é a disponibilidade de animais transgénicos, valiosa para elucidar o papel de genes individuais em eventos microcirculatórias modulação.
Tipos de tecidos
Uma vez que descrito pela primeira vez, a microscopia intravital tem sido utilizado em uma variedade de preparações microcirculatórias incluindo a bolsa da bochecha mestre, orelha de coelho, mesentério do roedor, e cremaster. Uma desvantagem principal associado com a maior parte destas preparações é a activação potencial das células por manipulação cirúrgica acompanhada com um aumento transiente em leucócitos de rolamento e aderente que tem sido bem descrito para o mesentério. Preparação cremastérico 30 tem, portanto, ser efectuada com extremo cuidado. Para nossa experiência, humidificante frequente do tecido exposto e cauterização restritiva, bem como um período de estabilização suficiente do tecido de pelo menos 30 minutos ajuda a evitar ou reduzir de leucócitosestimulação.
Uma grande vantagem da imagem cremastérico sobre imagiologia mesentérica é a fácil acessibilidade que poupa abertura da cavidade abdominal. Trauma cirúrgico geral é reduzido e montagem em qualquer um Plexiglas viram palco para iluminação transmitida ou, se utilizados em nosso protocolo, uma plataforma de alumínio térmico controlado para epi-illumintaion é facilmente realizada. Além disso, a gordura que recolhe cerca de vénulas pós-capilares em animais mais velhos limitantes de imagem mesentérica está ausente em volta do tecido cremastérico.
Rotulagem de leucócitos
Reagentes tais como rodamina 6G 31, laranja de acridina ou vermelho de acridina qual os núcleos de manchas e / ou organelos intracelulares que não são encontrados em células vermelhas do sangue acumular selectivamente em leucócitos (e até certo ponto em plaquetas e células endoteliais). 32 Nós preferimos usar 6G rodamina para a detecção de leucócitos, em concentrações de 0,4 mg de peso corporal / kg, que tem previously sido demonstrado que não têm nenhum efeito significativo sobre a activação de neutrófilos. 33 laranja de acridina mostrou fundo muito mais mancha e fototoxicidade por meio de vasoconstrição arteriolar (observações não publicadas). A utilização de LEDs para imagiologia de fluorescência fornece espectros de excitação precisa e permite que as aplicações mais complexas, tais como a combinação de diferentes comprimentos de onda, por exemplo para a detecção de activação de leucócitos e vazamento capilar, ao mesmo tempo e devem, portanto, ser o método de escolha no futuro do em in vivo de imagem.
IRI no tecido cremastérico
Aplicando isquemia no músculo cremaster pode ser facilmente realizado e reflete perfeitamente as condições clinicamente relevantes, tais como a cirurgia de retalho livre. Além disso, as modificações tais como a isquemia fria, quente ou isquemia de superfusão cremastérico com substâncias que influenciam a inflamação pode ser facilmente aplicado. Injecção Intrascrotal pode ser o método de Choice quando o tratamento do tecido cremastérico é necessária horas ou dias antes da gravação.
Uma variedade de cursos de tempo para IRI pode ser utilizado, dependendo do nível de prejuízo requeridos. Nós aqui descrever um modelo de isquemia 30 minutos para produzir níveis significativos de rolamento após duas horas de reperfusão (Figura 3) através da contagem de glóbulos brancos que passam de um ponto fixo através do vaso. Com o aumento no rolamento é moderado deixa bastante potencial para estimular leucócitos no IRI através de outras drogas de interesse. No entanto, uma variedade de cursos de tempo podem ser utilizados dependendo do nível de activação de leucócitos necessário 21, 25 a adesão de leucócitos é mais frequentemente medido por contagem de células claramente visíveis na parede do vaso em um 100 -. 200 uM de estiramento que permanecem estacionários durante 30 s , embora este tempo pode variar entre laboratórios. Observou-se um aumento marcado no número de leucócitos aderentes em IRI que obtiveram significativa após 60 minutos.
Em conclusão microscopia de epifluorescência intravital no IRI de tecido muscular estriado pode ser bem aplicado em tecidos de ratos cremastérico uma vez que fornece dados reprodutíveis de ativação em leucócitos in vivo para pesquisa inflamação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por uma concessão do "Deutsche Forschungsgemeinschaft" para SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 - A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32x32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
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