En fluorescens<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) fremgangsmåde blev udviklet til visuelt detektere viralt genomisk RNA ved hjælp af fluorescensmikroskopi. En probe fremstillet med specificitet for det virale RNA, som derefter kan identificeres ved anvendelse af en kombination af hybridisering og immunfluorescensteknikker. Denne teknik har den fordel at identificere lokaliseringen af det virale RNA eller DNA ved steady-state, der giver oplysninger om kontrol af intracellulære virus menneskehandel begivenheder.
Virus, der inficerer celler fremkalder specifikke ændringer normale cellefunktioner, der tjener til at aflede energi og midler til viral replikation. Mange aspekter af værtscellen funktion er beslaglagt af vira, sædvanligvis ved ekspressionen af virale genprodukter, der rekrutterer værtscelleproteiner og machineries. Hertil kommer, at virus ingeniør specifikke membranreceptorer organeller eller tag i mobil vesikler og motoriske proteiner rettet områder af cellen (i de novo-infektion selvsupplering vira molekylære motor proteiner til at målrette kernen; senere under viruskonstruktion, vil de kapre cellulær machineries, der vil hjælpe i den samling af virus). Mindre forstås, hvordan vira, især med RNA genomer, koordinere intracellulære handel både protein og RNA-komponenter, og hvor de opnår samlingen af infektiøse partikler ved specifikke loci i cellen. Undersøgelsen af RNA lokalisering begyndte i tidligere arbejde. Udvikling lavere eukaryote emembryoner og neuronale celler forudsat vigtig biologisk information, og også understregede betydningen af RNA lokalisering i planlægningen af genekspression kaskader. Undersøgelsen i andre organismer og cellesystemer er givet tilsvarende vigtig information. Vira er obligate parasitter og skal udnytte deres værtsceller at kopiere. Det er således vigtigt at forstå, hvordan RNA-vira styre deres RNA genomer fra kernen gennem kerneporen gennem cytoplasmaet og videre til en af dens endelige bestemmelsessted, i afkommenes viruspartikler 1.
FISH tjener som et nyttigt værktøj til at identificere ændringer i steady-state lokalisering af virale RNA. Når det kombineres med immunofluorescens (IF) analyse 22, FISH / IF co-analyser vil give oplysninger om co-lokalisering af proteiner med den virale RNA 3. Denne analyse giver derfor et godt udgangspunkt for at teste for RNA-protein interaktioner med andre biokemiske eller biofysisketests 4,5, da co-lokalisering i sig selv er ikke nok beviser til at være sikker på en interaktion. Ved at studere viral RNA lokalisering ved hjælp af en metode som dette, er store mængder af information opnået på både virale og cellulære RNA handel begivenheder 6. For eksempel producerer HIV-1 RNA i kernen af inficerede celler, men RNA kun omsættes i cytoplasmaet. Når en tast viralt protein mangler (Rev) 7, har FISH af det virale RNA viste, at blokken til virusreplikation skyldes tilbageholdelse af HIV-1 genomiske RNA i kernen 8.
Her præsenteres fremgangsmåden til visuel analyse af viralt genomisk RNA in situ. Fremgangsmåden gør brug af en mærket RNA-probe. Denne sonde er designet til at være et supplement til de virale genomiske RNA. Under in vitro-syntese af antisense RNA-probe, den ribonukleotid, som er modificeret med digoxigenin (DIG) er inkluderet i en in vitro transcription reaktion. Når proben er hybridiseret til mål-mRNA i celler, vil efterfølgende antistof mærkning trin (fig. 1) viser lokaliseringen af mRNA og proteiner af interesse i forbindelse med udførelsen FISH / IF.
FISH / IF co-analyser er en pålidelig metode til at visualisere viralt RNA i celler, som nu er raffineret 9,15,16. I løbet af flere år, har vi udviklet en forbedret metode til farvning til RNA. Denne teknik kan anvendes på en lang række celletyper, forudsat at proben er specifik for mål-RNA'et 17. Ved mærkning af sonden med DIG, er vi i stand til at visualisere de RNA ved simpel farvning. Ved farvning for RNA og andre proteiner er kombineret, FISH / IF co-analyser bliver et kraftfuldt værktøj til at observere cellulære strukturer og protein / RNA lokalisering.
Specificiteten af RNA detektion er ganske høj. Dette er illustreret i figur 2. I nogle af de oprindelige arbejde, der fokuserede på viral genomisk RNA lokalisering, FISH fastslået, at en manglende Rev fanget virale RNA i cellekernen 18. Da dette, har rigelig nye oplysninger om viral genomisk RNA lokalisering er opnået ved hjælp af technique skitseret her. Ved overekspression cellulære proteiner, kan specifikke populationer-og ikke alle af det virale RNA blive tvunget til at lokalisere forskellige områder af cellen. RILP overekspression, hvilket ligner fænotype opnås, når hnRNP A2 er forårsaget af siRNA i HIV-1-udtrykkende celler 13, bevirker RNA'et til synligt akkumuleres ved MTOC. De virale genomiske RNA kan skubbes til cellen periferien ved at deaktivere minus-ende motor protein dynein: p50/Dynamitin overekspression eller knockdown af dynein tunge kæder 1 resulterer i frigivelse af viralt genomisk RNA fra intracellulære domæner til cellulære periferien ( figur 2). En mutant af RILP, RILPΔN, som ikke længere binder dynein motoren, dispergerer endosomer (mærket ved LAMP1) i cytoplasmaet, fordi de ikke længere aktivt lokaliseret ved juxtanuclear domæner. Disse resultater peger på begrebet plast population af HIV-1 genomiske RNA og i særdeleshed, at forskellige pools af HIV-1 genomiskeRNA eksisterer med undertiden identificerbare roller i den virale replikationscyklus. Disse samme begreber er allerede blevet identificeret for proteinet kodet af dette mRNA, Gag 19.
Der er begrænsninger for brugen af FISH / IF co-analyser, der er relateret til antistof valg og tilgængelighed. Optimering af den bedste kombination af primære og sekundære antistoffer, og deres koncentrationer, det tager tid at optimere (se tabel 1 og 2). Antistoffer fremstillet af hybridomer eller fremstillet af store virksomheder kan have koncentrationer, der varierer lige fra 1:2 til 1:2000, men sørg for at følge de retningslinjer, som producenten for de bedste resultater. Den vært, hvori antistoffet er fremstillet, skal også tages under overvejelse. Blanding får med gedeantistoffer bør også undgås i primære og sekundære antistoffer som denne kombination resulterer i høj baggrund på grund af kryds-art genkendelse (data ikke vist). For Alexa-Fluor Secondary antistoffer kan koncentrationen anvendes ved 1:500 til næsten ethvert antistof i sættet. Den anden ulempe ved at FISH / IF co-analyser som beskrevet i denne rapport er den indfanger den RNA ved sin beliggenhed ved steady-state, efter at cellerne er blevet rettet, og permeabiliseres med paraformaldehyd og opvaskemiddel (figur 1).
Imidlertid har RNA billeddannelse i levende celler er blevet opnået ved en række midler 20-22, mest hjælp af forskellige former virale RNA genomer, der er mærket med fluorescerende proteiner, såsom GFP. Men yderligere midler til at identificere RNA lokalisering i levende celler fortsætter op til overfladen. Disse nye fremgangsmåder involverer mærkning RNA ved hjælp af spinat 23, SNAP 24 eller MTRIP 2. Disse teknikker lider også nogle ulemper, herunder kravet om at permeabilisere cellerne før tilsætning af substrater eller en del skal manipuleres til at kode mRNA for detektere mRNA ved mikroskopi. Faktisk er den største advantage af FISH analyser er beskrevet i denne rapport er, at det native RNA er uændret, der fører til de mest fysiologisk relevante resultater.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker tidligere og nuværende medlemmer af laboratoriet for bidrag til udviklingen af metoden skitseret her og Alan Cochrane for at få råd. LA er en modtager af en canadisk Institutes of Health Research (CIHR) Ph.d. Fellowship og AJM understøttes af et Fraser, Monat og MacPherson Career Award. Dette arbejde understøttes af en bevilling fra CIHR (tilskud # MOP-56.974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.