Une fluorescence<em> In situ</emHybridation> (FISH) a été développée pour détecter visuellement ARN génomique viral en utilisant la microscopie à fluorescence. Une sonde est faite avec une spécificité de l'ARN viral qui peut ensuite être identifiés en utilisant une combinaison de l'hybridation et des techniques d'immunofluorescence. Cette technique offre l'avantage d'identifier la localisation de l'ARN viral ou ADN à l'état stationnaire, fournissant des informations sur le contrôle des événements intracellulaires trafic de virus.
Les virus qui infectent les cellules de susciter des modifications spécifiques à des fonctions cellulaires normales qui servent à détourner l'énergie et des ressources pour la réplication virale. De nombreux aspects de la fonction des cellules d'accueil sont réquisitionnés par des virus, habituellement par l'expression de produits de gènes viraux que les protéines de la cellule hôte et de recruter de machineries. En outre, les virus organites ingénieur membranaires spécifiques ou étiquette sur au vésicules mobiles et des protéines à moteur à cibler les régions de la cellule (cours de l'infection de novo, virus coopter protéines moteur moléculaires pour cibler le noyau; plus tard, pendant l'assemblage du virus, ils se détournent cellulaire mécanismes qui aideront à l'assemblage des virus). Moins on entend sur la façon dont les virus, en particulier ceux dont les génomes ARN, de coordonner le trafic intracellulaire de protéines et de composants d'ARN et de la façon dont ils obtenir l'assemblage des particules infectieuses à des loci spécifiques dans la cellule. L'étude de la localisation d'ARN a commencé dans les travaux antérieurs. Développer em eucaryotes inférieursbryos et les cellules neuronales fourni d'importantes informations biologiques, et a également souligné l'importance de la localisation d'ARN dans la programmation des cascades d'expression des gènes. L'étude dans d'autres organismes et des systèmes cellulaires a donné des informations importantes similaire. Les virus sont des parasites obligatoires et doivent utiliser leurs cellules hôtes pour se répliquer. Ainsi, il est essentiel de comprendre comment les virus à ARN diriger leurs génomes ARN du noyau, à travers le pore nucléaire, à travers le cytoplasme et sur l'un de ses destinations finales, dans les particules virales descendance 1.
POISSON sert comme un outil utile pour identifier les changements dans l'état d'équilibre de localisation de l'ARN viral. Lorsqu'il est combiné avec l'immunofluorescence (IF) analyse 22, FISH / SI co-analyses fourniront des renseignements sur la co-localisation des protéines avec l'ARN viral 3. Cette analyse fournit donc un bon point de départ pour tester les interactions ARN-protéine par des techniques biochimiques ou biophysiques d'autresessais 4,5, étant donné que la co-localisation par lui-même n'est pas assez de preuves pour être certain d'une interaction. En étudiant la localisation d'ARN viral en utilisant une méthode de ce genre, des informations abondantes a été acquise sur les deux événements viraux et cellulaires de trafic d'ARN 6. Par exemple, le VIH-1 produit des ARN dans le noyau des cellules infectées, mais l'ARN est seulement traduit dans le cytoplasme. Quand on protéine clé virale est manquant (Rev) 7, POISSON de l'ARN viral a révélé que le bloc à la réplication virale est due à la rétention des VIH-1 ARN génomique dans le noyau 8.
Ici, nous présentons la méthode pour l'analyse visuelle des ARN génomique viral in situ. La méthode permet l'utilisation d'une sonde marquée ARN. Cette sonde est conçue pour être complémentaire de l'ARN génomique viral. Au cours de la synthèse in vitro de la sonde ARN antisens, le ribonucléotide qui est modifié avec de la digoxigénine (DIG) est inclus dans un essai in vitro transcription réactionnel. Une fois la sonde s'est hybridée à l'ARNm cible dans les cellules, les étapes ultérieures de l'étiquetage d'anticorps (figure 1) permettra de connaître la localisation de l'ARNm ainsi que des protéines d'intérêt lors de l'exécution FISH / SI.
FISH / SI co-analyses est une méthode fiable de visualiser l'ARN viral dans les cellules qui a été affiné 9,15,16. Au cours de plusieurs années, nous avons développé une méthode raffinée de la coloration de l'ARN. Cette technique peut être utilisée sur un large éventail de types de cellules à condition que la sonde est spécifique à l'ARN cible 17. Par marquage de la sonde avec DIG, nous sommes capables de visualiser des ARN par coloration simple. Lorsque la coloration de l'ARN et des protéines d'autres sont combinés, FISH / SI co-analyses deviennent un outil puissant d'observer des structures cellulaires et protéine / ARN de localisation.
La spécificité de la détection de l'ARN est assez élevé. Ceci est illustré dans la figure 2. Dans certains de l'œuvre originale qui mettait l'accent sur la génomique de localisation d'ARN viral, POISSON établi que le manque de Rev piégé l'ARN viral dans le noyau 18. Depuis cela, abondante de nouvelles informations sur la localisation génomique virale ARN a été obtenu en utilisant la technique décrites ici. Par protéines cellulaires surexprimant, les populations-et spécifiques pas tous de l'ARN viral peut être forcé à se localiser au niveau de différentes régions de la cellule. Surexpression RILP, qui ressemble le phénotype obtenu lorsque hnRNP A2 est appauvri par des siRNA par le VIH-1-cellules exprimant 13, provoque l'ARN de manière visible s'accumulent à la MTOC. L'ARN viral génomique peut être poussé à la périphérie de la cellule en désactivant la protéine moteur moins-end, la dynéine: la surexpression p50/Dynamitin ou démontable des chaînes lourdes de dynéine 1 résultats dans la libération de l'ARN génomique viral à partir des domaines intracellulaires de la périphérie cellulaire ( Figure 2). Un mutant de RILP, RILPΔN, qui ne se lie plus le moteur dynéine, disperse les endosomes (marqués par LAMPE1) dans le cytoplasme, car ils ne sont plus activement localisés à des domaines juxtanucléaire. Ces résultats soulignent la notion d'une population en plastique du VIH-1 ARN génomique et en particulier, que les différents bassins du VIH-1 génomiqueARN existent avec des rôles parfois identifiables dans le cycle de réplication virale. Ces mêmes notions ont déjà été identifiés pour la protéine codée par cet ARNm, Gag 19.
Il ya des limites à l'utilisation de FISH / SI co-analyses qui sont relatifs au choix d'anticorps et de disponibilité. L'optimisation de la meilleure combinaison d'anticorps primaires et secondaires, et leurs concentrations, prendra du temps pour optimiser (voir le tableau 1 & 2). Anticorps faites à partir d'hybridomes ou produites par les grandes entreprises peuvent avoir des concentrations qui varient de 1:2 à n'importe 1:2000, mais assurez-vous de suivre les directives fournies par le fabricant pour obtenir les meilleurs résultats. L'hôte dans lequel l'anticorps est produit doivent également être pris en considération. Moutons de mélange avec des anticorps de chèvre doit également être évitée dans les anticorps primaires et secondaires, il en résulte combinaison en arrière-plan haute en raison de contre-reconnaissance des espèces (données non présentées). Pour Alexa Fluor-secondaanticorps ry, la concentration peut être utilisé à 1:500 pour presque tous les anticorps dans l'ensemble. L'autre inconvénient de FISH / SI co-analyses tel que décrit dans le présent rapport est-il capte les ARN à son emplacement à l'état stationnaire, après que les cellules ont été fixées et perméabilisées avec du paraformaldéhyde et de détergent (figure 1).
Toutefois, l'ARN dans les cellules vivantes d'imagerie a été obtenu grâce à une variété de moyens 20-22, la plupart du temps en utilisant des variations de génomes ARN viral qui sont marqués par des protéines fluorescentes comme la GFP. Cependant, des moyens supplémentaires afin d'identifier la localisation d'ARN dans les cellules vivantes continuent de faire surface. Ces nouvelles méthodes impliquent des ARN de marquage à l'aide d'épinards 23, 24, SNAP ou mTrip 2. Ces techniques souffrent également de quelques inconvénients, y compris l'obligation de perméabiliser les cellules avant d'ajouter que substrats ou un fragment doit être conçu pour marquer l'ARNm dans le but de détecter l'ARNm par microscopie. En effet, le progrès le grandntage des analyses FISH décrites dans le présent rapport réside dans le fait que le natif d'ARN n'est pas altérée conduisant à des résultats les plus pertinents physiologiquement.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents du laboratoire pour ses contributions à l'élaboration de la méthodologie exposée ici et à Alan Cochrane pour obtenir des conseils. Los Angeles est un bénéficiaire d'une Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC) Bourse de doctorat et de AJM est soutenu par une bourse de carrière du Fraser, Monat et MacPherson. Ce travail est soutenu par une subvention de l'IRSC (subvention n MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.