Um fluorescência<em> In situ</em> Hibridação método (FISH) foi desenvolvido para detectar visualmente virais RNA genómico usando microscopia de fluorescência. Uma sonda é feita com especificidade para o RNA viral que pode então ser identificados usando uma combinação de hibridação e técnicas de imunofluorescência. Esta técnica oferece a vantagem de identificar a localização do RNA viral ou DNA no estado estacionário, fornecendo informações sobre o controle de eventos intracelulares tráfico de vírus.
Os vírus que infectam células provocam alterações específicas para as funções celulares normais que servem para desviar a energia e recursos para a replicação viral. Muitos aspectos da função da célula hospedeira são comandados por vírus, geralmente por a expressão de produtos de genes virais que proteínas do hospedeiro recrutam celulares e máquinas. Além disso, os vírus engenheiro organelas de membrana específicos ou de marcas sobre a vesículas celulares e proteínas de motor para alvejar regiões da célula (durante a infecção de novo, vírus cooptar proteínas motor molecular para alvejar o núcleo, mais tarde, durante a montagem do vírus, eles irão sequestrar celular máquinas que ajudarão na montagem de vírus). Menos é entendido sobre a forma como os vírus, em particular aqueles com genoma de RNA, coordenar o tráfico intracelular de proteínas e componentes de ARN e como eles atingir a montagem de partículas infecciosas em loci específicos na célula. O estudo de localização de RNA começou em trabalhos anteriores. Desenvolver menor EM eucarióticasbryos e células neuronais, desde a informação biológica importante, e também ressaltou a importância da localização RNA na programação de cascatas de expressão gênica. O estudo em outros organismos e sistemas celulares rendeu informações importantes semelhante. Vírus são parasitas obrigatórios e devem utilizar suas células hospedeiras para replicar. Assim, é crítico para compreender como os vírus de RNA dirigir genomas seu RNA a partir do núcleo, através do poro nuclear, através do citoplasma e em que um dos seus destinos finais, em partículas progenitura do vírus 1.
FISH serve como uma ferramenta útil para identificar mudanças de estado estacionário localização do RNA viral. Quando combinado com imunofluorescência (IF) análise 22, FISH / IF co-análises irá fornecer informações sobre a co-localização de proteínas com o RNA viral 3. Esta análise, portanto, fornece um bom ponto de partida para testar a RNA-proteína interações, bioquímica ou outro biofísicotestes de 4,5, já que co-localização, por si só não é evidência suficiente para ter a certeza de uma interação. Ao estudar a localização de RNA viral utilizando um método como este, abundante informação foi obtida em ambos os virais e celulares eventos tráfico de RNA 6. Por exemplo, o HIV-1 produz RNA no núcleo de células infectadas mas o RNA é apenas traduzida no citoplasma. Quando uma proteína viral chave está ausente (Ap) 7, FISH do RNA viral revelou que o bloco para a replicação virai é devido à retenção de HIV-1 RNA genómico no núcleo 8.
Aqui, apresentamos o método de análise visual de virais RNA genômica in situ. O método faz uso de uma sonda de RNA etiquetado. Esta sonda foi projetada para ser complementar ao RNA genômico viral. Durante a síntese in vitro do RNA antisense da sonda, o ribonucleótido que é modificado com digoxigenina (DIG) está incluído em um in vitro transcription reacção. Uma vez que a sonda tem hibridado com o mRNA alvo nas células, as etapas subsequentes de anticorpos de rotulagem (Figura 1) irá revelar a localização do mRNA, bem como proteínas de interesse ao realizar FISH / IF.
FISH / IF co-análise é um método confiável para visualizar o RNA viral em células que já foi refinada 9,15,16. Ao longo de vários anos, foi desenvolvido um método refinado de coloração para o RNA. Esta técnica pode ser usado em uma grande variedade de tipos de células, desde a sonda é específico para o RNA alvo 17. Ao classificar a sonda com DIG, somos capazes de visualizar as RNA por coloração simples. Quando a coloração para RNA e outras proteínas são combinados, FISH / IF co-análises se tornar uma ferramenta poderosa para observar as estruturas celulares e proteína / RNA localização.
A especificidade da detecção de RNA é bastante elevada. Isto é ilustrado na Figura 2. Em alguns do trabalho original, centrado na localização genômica viral RNA, FISH estabelecido que a falta de Rev preso RNA viral no núcleo 18. Uma vez que este, a nova informação abundante na localização viral genómico RNA foi obtido usando o technique descritos aqui. Por proteínas superexpressando celulares, as populações-e específicos não todo-do RNA viral pode ser forçado para localizar a diferentes regiões da célula. RILP superexpressão, que se assemelha ao fenótipo obtido quando hnRNP A2 está esgotada por siRNA em HIV-1-expressando células 13, faz com que o RNA para visivelmente acumular no MTOC. O RNA genômico viral pode ser empurrada para a periferia da célula, desativando a proteína do motor menos-end, dineína: superexpressão p50/Dynamitin ou knockdown dos pesados cadeia dineína 1 resulta na liberação de vírus RNA genômico de domínios intracelulares para a periferia celular ( A Figura 2). Um mutante de RILP, RILPΔN, que já não se liga o motor dineína, dispersa endossomas (marcado por LAMP1) para o citoplasma, porque eles não são mais ativamente localizados em domínios juxtanuclear. Estes resultados indicam a noção de uma população de plástico de HIV-1 RNA genómico e, em particular, que os pools diferentes de HIV-1 genómicoRNA existir com papéis, por vezes, identificáveis no ciclo de replicação virai. Estas mesmas noções já foram identificados para a proteína codificada por este ARNm, Gag 19.
Existem limitações para os usos de FISH / IF co-análises que estão relacionados à escolha de anticorpos e disponibilidade. A otimização da melhor combinação de anticorpos primários e secundários, e suas concentrações, vai levar tempo para otimizar (ver Tabela 1 e 2). Os anticorpos produzidos a partir de hibridomas ou produzidos por grandes empresas podem ter concentrações que variam em qualquer lugar de 1:2 a 1:2000, mas não se esqueça de seguir as orientações fornecidas pelo fabricante para obter melhores resultados. O hospedeiro no qual o anticorpo é produzido também deve ser tomado em consideração. Ovelhas mistura com anticorpos de cabra também deve ser evitado em anticorpos primário e secundário como esta combinação resulta em fundo elevado, devido ao reconhecimento de espécies cruzadas (dados não mostrados). Para Alexa-Fluor secondaanticorpos ry, a concentração pode ser usado em 1:500 para quase qualquer anticorpo no conjunto. O outro inconveniente para FISH / se o co-análises como descrito neste relatório é que capta o RNA no seu local no estado estacionário, após as células foram fixadas e permeabilizadas usando paraformaldeído e detergente (Figura 1).
No entanto, o RNA de imagem em células vivas foi conseguida através de uma variedade de meios 20-22, na maioria utilizando variações dos genomas virais de ARN que são marcados por proteínas fluorescentes, tais como GFP. No entanto, os meios adicionais para identificar a localização de RNA em células vivas continuar a superfície. Estes novos métodos envolvem o RNA de marcação por meio de espinafre 23, SNAP 24, ou MTRIP 2. Estas técnicas também sofrem de algumas desvantagens, incluindo o requisito para permeabilizar as células antes de adicionar substratos ou que uma porção deve ser concebida para marcar o mRNA a fim detectar o mRNA por microscopia. Com efeito, a maior advantage de análises de FISH descritas neste relatório reside no facto de que o RNA nativa é inalterado levando a os resultados mais fisiologicamente relevantes.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a membros do passado e do presente do laboratório para as contribuições para o desenvolvimento da metodologia descrita aqui e Alan Cochrane para o conselho. LA é um receptor de um Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e doutorado AJM é apoiado por um Prémio Carreira Fraser, Monat e MacPherson. Este trabalho é apoiado por uma subvenção do CIHR (concessão # MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.