蛍光<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション(FISH)法は視覚的に蛍光顕微鏡を用いてウイルスゲノムRNAを検出するために開発されました。プローブをハイブリダイゼーションと免疫蛍光技術の組み合わせを用いて同定することができるウイルスRNAに特異性で作られています。この手法は、細胞内のウイルスの人身売買のイベントの制御に関する情報を提供し、定常状態でウイルスRNAまたはDNAの局在を同定するという利点があります。
細胞はウイルス複製のためのエネルギーや資源を流用するのに役立つ正常な細胞機能に固有の変更を誘発感染するウイルス。宿主細胞の機能の多くの側面は、通常、募集宿主細胞タンパク質と機械そのウイルスの遺伝子産物の発現により、ウイルスによって徴用されています。また、de novoの感染時にセルの領域(ターゲットとするモバイル小胞とモータータンパク質の上でウイルスエンジニア特定の膜小器官またはタグを、ウイルス共同OPT分子モータータンパク質は、核を対象とする。以降では、ウイルスの組み立て時に、彼らは携帯電話ハイジャックされウイルスの組み立てに役立ちます機械)。以下は、ウイルスは、特にRNAゲノムを持つものは、タンパク質とRNAの両方のコンポーネントの細胞内輸送を調整し、それらが細胞内の特定の遺伝子座での感染性粒子のアセンブリを達成する方法をどのように理解されています。 RNAの局在化の研究は、以前の仕事に始まりました。 EMは、下等真核生物の開発bryosと神経細胞は、生物学的に重要な情報を提供し、また、遺伝子発現カスケードのプログラミングでRNAの局在化の重要性を強調した。他の生物と細胞システムの研究では、同様の重要な情報が得られている。ウイルスは絶対寄生虫であり、複製するためにそれらの宿主細胞を利用する必要があります。したがって、RNAウイルスが子孫ウイルス粒子1に、核から、核膜孔を介して、細胞質を通って最終的な宛先のいずれかに彼らのRNAゲノムを指示する方法を理解することが重要です。
FISHは、ウイルスRNAの定常状態の局在の変化を識別するために有用なツールとして機能します。免疫蛍光法(IF)の解析22と組み合わせると、FISH / IFの共同分析では、ウイルスRNAの3タンパク質の共局在についての情報を提供します。この分析は、したがって、他の生化学的または生物物理学によってRNA-タンパク質相互作用をテストするための良い出発点を提供しています単独での共局在から4,5のテストでは、相互作用の特定であるための十分な証拠はありません。このような方法を用いてウイルスRNAの局在化の研究に、豊富な情報は、ウイルスと細胞のRNAの人身売買のイベント6の両方で得られている。例えば、HIV-1感染細胞の核内でRNAを生成しますが、RNAは、細胞質に翻訳されています。つのキーウイルスタンパク質が欠落している(改訂)7、ウイルスRNAのFISHは、ウイルス複製のブロックが核8 HIV-1ゲノムRNAの保持によるものであることを明らかにした。
ここでは、 その場でウイルスゲノムRNAの視覚的な分析手法を提案する。方法は、標識したRNAプローブを使用しています。このプローブは、ウイルスのゲノムRNAと相補的になるように設計されています。アンチセンスRNAプローブのin vitro合成中に、ジゴキシゲニン(DIG)で修飾されているリボヌクレオチドは 、in vitro で transcrに含まれていますiption反応。プローブは、細胞内の標的mRNAにハイブリダイズした後にFISH / IFを実行するときに、その後の抗体標識のステップ( 図1)は、mRNAの局在だけでなく、目的のタンパク質を明らかにする。
FISH / IFの共同分析では、現在9,15,16洗練された細胞内でウイルスRNAを可視化する信頼性の高い方法です。数年にわたって、我々はRNAを染色の洗練された方法を開発した。この手法は、プローブが標的RNA 17に固有のもので設けられたセルの種類の幅広い使用することができます。 DIGプローブを標識することによって、我々は単純な染色によるRNAを可視化することが可能である。 RNAと他のタンパク質を染色するが結合されたときに、FISH / IF共同分析は、細胞の構造と蛋白質/ RNAの局在を観察するための強力なツールになります。
RNA検出の特異性はかなり高いです。これは図2に示されています。ウイルスゲノムRNAの局在化に焦点を当てたオリジナル作品の一部で、FISHは、Revの欠如が核18でウイルスRNAをトラップことを確立した。これ以来、ウイルスゲノムRNAの局在化に関する豊富な新しい情報がtechniquを使用して得られたeは、ここで概説した。過剰発現細胞のタンパク質によって、特定の集団としないウイルスRNAすべてのセルの異なる領域にローカライズするために強制することができます。のhnRNP A2がでsiRNAによって枯渇した場合に得られる表現型HIV-1発現細胞を13に似ているRILPの過剰発現は、RNAが目に見えてMTOCに蓄積させる。 (携帯周囲に細胞内ドメインからのウイルスゲノムRNAのリリースでは、ダイニン重鎖1の結果のp50/Dynamitin過剰発現やノックダウン:ウイルスゲノムRNAはマイナス端モータータンパク質、ダイニンを無効にすることにより、細胞周囲にプッシュすることができます図2)。彼らはもはや積極的にjuxtanuclearドメインに局在しているため、もはやダイニンモーターをバインドされることはありませんRILP、RILPΔNの変異体は、分散するには、細胞質に(LAMP1でタグ付けされた)エンドソーム。これらの結果は、HIV-1ゲノムRNAの、特にプラスチック製の人口の概念を指すようHIV-1ゲノムの異なるプールウイルス複製サイクルの中で時々識別可能な役割と存在するRNA。これらの同じ概念は、すでにこのmRNAによってコードされるタンパク質、ギャグ19の同定されている。
抗体の選択性と可用性に関連するFISH / IFの共同分析の用途に制限があります。一次および二次抗体の最適な組み合わせの最適化、およびそれらの濃度は、( 表1&2を参照) を最適化するために時間がかかります。大手企業によるハイブリドーマから作られた、または産生された抗体は、1:2から1:2000にどこでも異なる濃度を持っていますが、最良の結果を得るために製造元から提供されているガイドラインに従ってくださいすることができます。抗体が生成されているホストも考慮の下で撮影する必要があります。ヤギ抗体との混合の羊はまた、クロス種認識(データは示さず)に起因する高いバックグラウンドでこの組み合わせの結果として、一次および二次抗体は避けるべきである。アレクサ·弗素seconda用RY抗体は、濃度は、セットのほぼすべての抗体を1:500で使用することができます。このレポートで説明したようにFISH /共同分析IFへの他の欠点は、細胞を固定し、パラホルムアルデヒドと洗剤( 図1)を使用して透過された後、それが定常状態でその位置でRNAを捕捉します。
しかし、生細胞内RNAイメージングは、主にGFPなどの蛍光タンパク質でタグ付けされたウイルスRNAゲノムのバリエーションを使用して、手段20から22までのさまざまなを実現しました。しかし、生細胞中のRNAの局在を同定するための追加手段が表面に進みます。これらの新しいメソッドは、ほうれん草23、SNAP 24の手段、またはMTRIP 2タギングRNAを含んでいます。これらの技術はまた部分が顕微鏡でmRNAを検出するためにmRNAをタグ付けするように設計されなければならないこと基板を追加したりする前に、細胞を透過処理するための要件を含むいくつかの欠点がある。確かに、主要なアドバこのレポートで概説したFISH解析のntageは、ネイティブのRNAが最も生理学的に関連性の高い結果につながる不変であるという事実にある。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、アドバイスのためにここで説明する手法の開発へとアランコクランへの貢献のためにラボの過去と現在のメンバーに感謝します。 LAは、フレイザー、モナトとマクファーソンキャリア賞でサポートされている保健研究(CIHR)博士フェローシップとAJMのカナダの協会の者です。この作品は、CIHR(助成金#MOP-56974)からの助成金によってサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.