En fluorescens<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) metoden ble utviklet for å visuelt oppdage virus genomisk RNA bruker fluorescens mikroskopi. En sonde er laget med spesifisitet til de virale RNA som deretter kan identifiseres ved hjelp av en kombinasjon av hybridisering og immunfluorescens teknikker. Denne teknikken har den fordelen av å identifisere lokalisering av de virale RNA eller DNA ved steady-state, gi informasjon om kontroll av intracellulære virus menneskehandel hendelser.
Virus som infiserer celler lokke fram konkrete endringer normale cellefunksjoner som tjener til å avlede energi og ressurser for virusreplikasjon. Mange aspekter av vertscellen funksjon er rekvirert av virus, vanligvis av uttrykket av viral genprodukter som rekrutterer vertscellen proteiner og machineries. Videre til virus ingeniør bestemte membran organeller eller koden på til mobile blemmer og motor proteiner målrette deler av cellen (under de novo infeksjon, virus co-opt molekylære motor proteiner å målrette kjernen; senere, under virus montering, vil de kapre mobilnettet machineries som vil hjelpe i monteringen av virus). Mindre blir forstått på hvordan virus, særlig de med RNA genom, koordinere intracellulær trafficking av både protein og RNA komponenter og hvordan de oppnår montering av smittsomme partikler på bestemte loci i cellen. Studiet av RNA lokalisering startet i tidligere arbeid. Utvikling lavere eukaryote embryos og nevrale celler ga viktig biologisk informasjon, og understreket også betydningen av RNA lokalisering i programmering av genuttrykk kaskader. Studien i andre organismer og celle-systemer har gitt tilsvarende viktig informasjon. Virus er obligate parasitter og må utnytte sine vertsceller å replikere. Dermed er det avgjørende å forstå hvordan RNA-virus retter sine RNA genomer fra kjernen, gjennom kjernefysiske pore, gjennom cytoplasma og videre til en av sine endelige destinasjoner, til avkom viruspartikler 1.
FISH fungerer som et nyttig verktøy for å identifisere endringer i steady-state lokalisering av virale RNA. Når det kombineres med immunfluorescens (IF) analyse 22, FISH / IF co-analyser vil gi informasjon om samlokalisering av proteiner med viral RNA tre. Denne analysen gir derfor et godt utgangspunkt for å teste for RNA-protein interaksjoner med andre biokjemiske eller biofysisketester 4,5, siden samlokalisering i seg selv er ikke nok bevis til å være sikker på en interaksjon. I studere viral RNA lokalisering ved hjelp av en metode som dette, har rikelig informasjon er gjort på begge viral og cellulære RNA menneskehandel hendelser 6. For eksempel produserer HIV-1 RNA i kjernen av infiserte celler, men RNA er bare oversatt i cytoplasma. Når en nøkkel viral protein mangler (Rev) 7, har FISH av viral RNA avslørte at blokken til virusreplikasjon skyldes tilbakeholdelse av HIV-1 genomisk RNA i kjernen 8.
Her presenterer vi metoden for visuell analyse av viral genomisk RNA in situ. Metoden gjør bruk av en merket RNA probe. Denne sonden er konstruert for å være komplementær til de virale genomisk RNA. Under in vitro syntese av antisens RNA probe, det ribonukleotid som er modifisert med digoxigenin (DIG) er inkludert i en in vitro transcription reaksjon. Når sonden har hybridisert til målet mRNA i cellene, vil etterfølgende antistoff merking trinn (figur 1) viser lokalisering av mRNA samt proteiner av interesse når du utfører FISH / IF.
FISH / IF co-analyser er en pålitelig metode for å visualisere viral RNA i cellene som nå har blitt raffinert 9,15,16. I løpet av flere år har vi utviklet en raffinert metode for farging for RNA. Denne teknikken kan brukes på et bredt spekter av celletyper forutsatt at sonden er spesifikk for målet RNA 17. Ved merking sonden med DIG, er vi i stand til å visualisere RNA av enkle farging. Når farging for RNA og andre proteiner er kombinert, FISH / IF co-analyser bli et kraftig verktøy for å observere cellulære strukturer og protein / RNA lokalisering.
Spesifisiteten av RNA påvisning er ganske høy. Dette er illustrert i figur 2. I noen av de opprinnelige arbeid som fokuserte på viral genomisk RNA lokalisering, FISH fast at mangel på Rev fanget virale RNA i cellekjernen 18. Siden dette har rikelig ny informasjon om viral genomisk RNA lokalisering er innhentet ved hjelp av technique skissert her. Ved overekspresjon cellulære proteiner, kan spesifikke populasjoner-og ikke alle av de virale RNA bli tvunget til å lokalisere til ulike regioner i cellen. RILP overexpression, som ligner på fenotypen oppnås når hnRNP A2 er oppbrukt etter siRNA i HIV-1-uttrykke celler 13, fører til at RNA til synlig samle på MTOC. De viral genomisk RNA kan skyves til cellen periferien ved å deaktivere minus-end motor protein, dynein: p50/Dynamitin overuttrykte eller knockdown av dynein tunge kjeden 1 resulterer i utslipp av viral genomisk RNA fra intracellulære domener til mobilnettet periferien ( Figur 2). En mutant av RILP, RILPΔN, som ikke lenger binder dynein motor, endosomes sprer (merket med LAMP1) til cytoplasma fordi de ikke lenger aktivt lokalisert på juxtanuclear domener. Disse resultatene peker til forestillingen om en plast befolkning av HIV-1 genomisk RNA og spesielt, at ulike bassenger av HIV-1 genomiskRNA finnes med noen identifiserbare roller i virusreplikasjon syklus. De samme begrepene har allerede blitt identifisert for protein kodet av denne mRNA, Gag 19.
Det er begrensninger til bruken av FISH / IF co-analyser som er knyttet til antistoff valg og tilgjengelighet. Optimalisering av den beste kombinasjonen av primære og sekundære antistoffer, og deres konsentrasjoner, vil ta tid å optimalisere (se Tabell 1 & 2). Antistoffer laget av hybridomas eller produsert av store selskaper kan ha konsentrasjoner som varierer alt fra 01:02 til 1:2000, men pass på å følge retningslinjene gitt av produsenten for best resultat. Verten der antistoff er produsert må også tas under vurdering. Mixing sau med geit antistoffer bør også unngås i grunnskolen og videregående antistoffer som dette kombinasjonen resulterer i høy bakgrunn grunn til å kryss-arter anerkjennelse (data ikke vist). For Alexa-Fluor secondary antistoffer, kan konsentrasjonen bli brukt på 1:500 for nesten alle antistoff i settet. Den andre ulempen til FISH / IF co-analyser som beskrevet i denne rapporten er det fanger opp RNA på sitt sted ved steady-state, etter cellene har blitt fikset og permeabilized hjelp paraformaldehyde og vaskemiddel (figur 1).
Imidlertid har RNA bildebehandling i levende celler er oppnådd gjennom en rekke måter 20-22, for det meste med variasjoner av virale RNA-genomer som er merket med fluorescerende proteiner som GFP. Men ekstra midler til å identifisere RNA lokalisering i levende celler fortsette å dukke opp. Disse nye metodene involvere tagging RNA ved hjelp av spinat 23, SNAP 24, eller MTRIP to. Disse teknikkene også lider av noen ulemper herunder kravet til permeabilize celler før du legger underlag, eller at en fraksjon må være konstruert for å tagge mRNA for detektere mRNA ved mikroskopi. Ja, de store Advantage av FISH analyser skissert i denne rapporten ligger i det faktum at den innfødte RNA er uendret fører til de mest fysiologisk relevante resultatene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker tidligere og nåværende medlemmer av lab for bidrag til utviklingen av metodikken skissert her og til Alan Cochrane om råd. LA er en mottaker av en kanadisk Institutes of Health Research (CIHR) doc og AJM støttes av en Fraser, Monat og MacPherson Career Award. Dette arbeidet støttes av en bevilgning fra CIHR (tilskuddet # MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.