En fluorescens<em> In situ</em>-Hybridisering (FISH) metod utvecklades för att visuellt detektera virala genomiska RNA med fluorescensmikroskopi. En sond görs med specificitet för det virala RNA som sedan kan identifieras med användning av en kombination av hybridisering och immunofluorescens-tekniker. Denna teknik erbjuder fördelen att identifiera lokaliseringen av de virala RNA eller DNA vid steady-state, ger information om kontroll av intracellulära förlopp virus människohandel.
Virus som infekterar celler framkallar vissa ändringar normala cellfunktioner som tjänar till att avleda energi och resurser för virusreplikation. Många aspekter av värdcellen funktion är beslag av virus, vanligen genom uttryck av virala genprodukter som rekryterar värdcellproteiner och maskinerier. Dessutom, för att virus ingenjören specifika membranreceptorer organeller eller taggen på att mobil vesiklar och proteiner motoriska målregioner hos cellen (under de novo-infektion, virus adjungera molekylära motorproteiner att rikta kärnan; senare, under virussammansättningen, kommer de kapa cellulär maskinerier som hjälper vid montering av virus). Mindre förstås på hur virus, i synnerhet med RNA genom, samordna intracellulära handel med både protein och RNA-komponenter och hur de uppnår montering av infektiösa partiklar i specifika loci i cellen. Studien av RNA lokalisering började tidigare arbete. Utveckla lägre eukaryota embryos och neuronala celler som viktig biologisk information, och även betonade vikten av RNA lokalisering vid planeringen av Cascades genuttryck. Studien i andra organismer och cellsystem har gett liknande viktig information. Virus är obligata parasiter och måste utnyttja sina värdceller att replikera. Således är det viktigt att förstå hur RNA-virus rikta deras RNA-genom från kärnan, genom nukleär por, genom cytoplasman och vidare till en av dess slutliga destination, till partiklar virusavkomma 1.
FISH fungerar som ett användbart verktyg för att identifiera förändringar i steady-state lokalisering av viralt RNA. I kombination med immunofluorescens (IF) analys 22, FISH / IF co-analyser kommer att ge information om samlokalisering av proteiner med den virala RNA 3. Denna analys ger därför en bra utgångspunkt för att testa RNA-protein interaktioner med andra biokemiska eller biofysiskatester 4,5, eftersom co-lokalisering i sig är inte tillräckligt bevis för att vara säker på en interaktion. När man studerar viralt RNA lokalisering med hjälp av en metod som denna, har riklig information vunnits på både virala och cellulära RNA handel evenemang 6. Exempelvis producerar HIV-1 RNA i kärnan av infekterade celler men RNA-enbart translateras i cytoplasman. När en nyckel viralt protein som saknas (Rev) 7, har FISH av det virala RNA: t avslöjade att blocket på viral replikation beror på upprätthållande av HIV-1 genomiska RNA i kärnan 8.
Här presenterar vi en metod för visuell analys av viralt genomiskt RNA in situ. Metoden gör användningen av en märkt RNA-prob. Denna sond är utformad för att vara komplementära till de virala genomiska RNA. Under in vitro-syntes av antisens-RNA-sond, ribonukleotiden som är modifierad med digoxigenin (DIG) ingår i en in vitro-transcrivning reaktion. När väl sonden har hybridiserats till mål-mRNA i celler, kommer efterföljande antikroppsmärkning steg (figur 1) visar lokaliseringen av mRNA såväl som proteiner av intresse när man utför FISH / IF.
FISH / IF co-analyser är en pålitlig metod för att visualisera viralt RNA i celler som nu har förfinats 9,15,16. Under flera år har vi utvecklat en förfinad metod för färgning för RNA. Denna teknik kan användas på en mängd olika celltyper, förutsatt att sonden är specifik för mål-RNA 17. Genom att märka sonden med DIG, vi kan visualisera RNA genom en enkel färgning. Vid färgning av RNA och andra proteiner kombineras, FISH / IF co-analyser blivit ett kraftfullt verktyg för att observera cellulära strukturer och protein / RNA-lokalisering.
Specificiteten hos RNA-detektion är ganska hög. Detta illustreras i figur 2. I några av de ursprungliga arbete som fokuserar på viral genomisk RNA lokalisering, FISH konstaterat att bristen på Rev fångade viralt RNA i kärnan 18. Sedan detta har riklig ny information om viral genomisk RNA lokalisering erhållits med hjälp av technique som beskrivs här. Genom överexpression cellulära proteiner, kan specifika populationer-och inte helt av det virala RNA tvingas att lokalisera till olika regioner av cellen. RILP överexpression, som liknar den fenotyp som erhålls när hnRNP A2 är uttömda av siRNA i HIV-1-uttryckande celler 13, orsakar det RNA som synligt ackumulera vid MTOC. De virala genomiska RNA: t kan skjutas till cellen periferin genom att inaktivera minus-änden motorn proteinet, dynein: p50/Dynamitin överexpression eller knockdown av dynein tungkedjiga 1 resulterar i frisättning av viralt genomiskt RNA från intracellulära domäner till den cellulära periferin ( figur 2). En mutant av RILP, RILPΔN, som inte längre binder dynein motorn, endosomer skingrar (märkt med LAMP1) i cytoplasman eftersom de inte längre aktivt lokaliseras till juxtanuclear domäner. Dessa resultat pekar på begreppet plast population av HIV-1 genom-RNA och framför allt att olika pooler av HIV-1 genomisktRNA finns med ibland identifierbara roller i den virala replikationscykeln. Samma begrepp har redan identifierats för det protein som kodas av detta mRNA, Gag 19.
Det finns begränsningar av användningar av FISH / Om samtidig analyser som är relaterade till antikroppar val och tillgänglighet. Optimeringen av den bästa kombinationen av primära och sekundära antikroppar och deras koncentrationer, kommer att ta tid för att optimera (se tabell 1 och 2). Antikroppar gjorda av hybridom eller produceras av stora företag kan ha halter som varierar allt från 1:2 till 1:2000, men tänk på att följa de riktlinjer som tillverkaren för bästa resultat. Den värd i vilken antikroppen produceras måste också tas under övervägande. Blandning får med getantikroppar bör också undvikas i primära och sekundära antikroppar eftersom denna kombination resulterar i hög bakgrund på grund av att korsa-arter erkännande (data visas ej). För Alexa-Fluor secondary antikroppar kan koncentrationen användas vid 1:500 till nästan vilken som helst antikropp i uppsättningen. Den andra nackdelen med FISH / IF co-analyser som beskrivs i denna rapport är det fångar RNA vid sitt läge vid steady-state efter celler har rättats och permeabiliseras med paraformaldehyd och rengöringsmedel (figur 1).
Emellertid har RNA-avbildning i levande celler har uppnåtts genom en mängd olika medel 20-22, mest använda varianter av virala RNA-genom som är märkta med fluorescerande proteiner, såsom GFP. Men ytterligare medel för att identifiera RNA lokalisering i levande celler fortsätter till ytan. Dessa nya metoder engagera märka RNA med hjälp av spenat 23, SNAP 24 eller MTRIP 2. Dessa tekniker lider också av några nackdelar inklusive kravet på att permeabilisera cellerna före tillsats substrat eller som en molekyldel måste konstrueras för att märka den mRNA för detektering av mRNA genom mikroskopi. I själva verket, den huvudsakliga Advantage av FISH analyser som beskrivs i denna rapport ligger i det faktum att personen RNA oförändrad leder till de mest fysiologiskt relevanta resultaten.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar tidigare och nuvarande medlemmar i labbet för bidrag till utvecklingen av den metod som beskrivs här och Alan Cochrane för rådgivning. LA är en mottagare av en kanadensisk Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship och AJM stöds av en Fraser, Monat och MacPherson Karriär Award. Detta arbete stöds av ett bidrag från CIHR (bidrag # MOP-56.974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.