Tilpasning af Aspergillus niger Morfologi gennem tilsætning af Talkum mikropartikler

Summary

En fremgangsmåde til præcist generere og omfattende karakterisering morfologi filamentøs fungus

Abstract

Den filamentøse svamp A. niger er et almindeligt anvendte stamme i en lang række industrielle processer fra fødevarer til lægemiddelindustrien. En af de mest interessante og ofte ukontrollerbar karakteristika ved denne filamentøs organisme er en kompleks morfologi. Det spænder fra tætte kugleformede pellets til tyktflydende mycelia (figur 1). Forskellige procesparametre og bestanddele er kendte for at påvirke fungal morfologi ^1. Siden optimal produktivitet korrelerer stærkt med en bestemt morfologisk form, svampe morfologi ofte er en flaskehals i produktiviteten i industriel produktion.

En ligetil og elegant fremgangsmåde til præcist at kontrollere morfologiske form er tilsætningen af uorganiske uopløselige mikropartikler (såsom vandholdigt magnesiumsilicat, aluminiumoxid eller titansilicat oxid) til dyrkningsmediet bidrager til forøget enzymproduktion ^2-6. Da der er en obvskellige korrelation mellem mikro partikel afhængig morfologi og enzymproduktion det er ønskeligt at matematisk forbinde produktivitet og morfologiske udseende. Derfor er en kvantitativ præcis og holistisk morfologiske beskrivelse er målrettet.

Derfor præsenterer vi en metode til at generere og karakterisere mikro-partikler er afhængige af morfologiske strukturer og til at korrelere svampe morfologi med produktivitet (figur 1), som muligvis bidrager til en bedre forståelse af morfogenese af trådformede mikroorganismer.

Den rekombinante stamme A. niger SKAn1015 dyrkes i 72 timer i en 3 L omrørt tank bioreaktor. Ved tilsætning af talkum mikropartikler i koncentrationer på 1 g / L, 3 g / l og 10 g / L før inokulering forskellige morfologiske strukturer reproducerbart genereres. Sterile udtages prøver efter 24, 48 og 72 timer til bestemmelse af væksten fremskridt og aktiviteten af ​​det producerede enzym. Dendannede produkt er af høj værdi enzym β-fructofuranosidase en vigtig biokatalysator for neo-sukker dannelse i fødevarer eller farmaceutisk industri, der katalyserer bl.a. reaktion af sakkarose til glukose ^7-9. Derfor kvantificering af glucose efter tilsætning af saccharose indebærer den producerede mængde β-fructofuranosidasen. Glucose kvantificering fremstilles ved en GOD / POD-assay ^10, som er modificeret til high-throughput-analyse i 96-brønds mikro-titer-plader.

Svampe morfologi efter 72 timer undersøges i mikroskop og kendetegnet ved digital billedanalyse. Ved at gøre dette, er partikel form faktorer for svampe makro morfologi som Féret diameter, projiceret areal, omkreds, cirkularitet, aspect ratio, rundhed und soliditet beregnes med open source billedbehandling program ImageJ. Relevante parametre kombineres til et dimensionsløst morfologi antal (Mn) ^11, som muliggør en omfattende karakterisering affungal morfologi. Den tætte korrelation mellem morfologi antal og produktivitet er fremhævet af matematisk regression.

Protocol

1. Reaktor Opsætning og start af dyrkning

4 bioreaktor dyrkninger i alt udføres.

1. Anvende en 3 L omrørt tank bioreaktor med et arbejdsvolumen på 2,2 L til dyrkning af A. niger SKAn1015.
2. Hælde 72,6 g glucose, monohydrat i reaktoren og fyld op med 1,9 I deioniseret vand.
3. Installere reaktoren udstyr såsom 3 ledeplader, to seks blade disk turbinebladet, en pH-elektrode, en gasindgang med luftfilter, en afkøling finger, en afgangsluft køler med luftfilter, en nedsænket rør til steril udtagning med luftfilter og tilløbsslanger for medie, inokulum, syre og base.
4. Autoklaven reaktoren ved 121 ° C i 20 min.
5. Forbinder reaktoren med syre-base reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) og de tilsvarende pumper og etablere en pH-værdi på 5,0 ± 0,05 med pH-styreenheden.
6. Forbinde reaktoren med kølevand, og sætte varmekappenomkring reaktorbeholderen.
7. Installere temperatursensoren med tilsvarende styreenhed og etablere en temperatur på 37 ± 0,1 ° C ved temperaturkontrolenhed.
8. Monter agitation motoren på toppen af reaktoren, og bringe den i brug med en omrøringshastigheden på 200 min ^-1.
9. Tilsæt sterilt minimalt vækstmediet ¹¹ trug en af de sterile tilløbsslanger (250 ml). Til medium fremstilling alle komponenter blev autoklaveret ved 121 ° C i 20 minutter og blandes sammen. Tre dyrkninger komponenterne indbefatter talkum (3MgO • 4SiO ₂ • _H2O) i koncentrationer på 1 g / L (reaktor 2), 3 g / L (reaktor 3) og 10 g / L (reaktor 4). Før anvendelse, genopslæmmes mikropartikler i 50 mM natriumacetatpuffer (pH 6,5) og tilføje den til sterilt medium. I kontrolkulturer (uden partikler) erstatte mikro partikelsuspension med 50 mM natriumacetatpuffer (pH 6,5).
10. Tilsæt sporesuspension (inokulum) ens fremstillet i Wucherpfennig et. al (2011) ¹¹ trug en af de sterile tilløbsslanger (50 ml), således at koncentrationen af sporer udgør 1x10 ⁶ ml ^-1. Inokuleringen markerer starten af ​​dyrkningen (h = 0 timer).
11. Start beluftning med en hastighed på 1,0 L min ^-1.

2. Sterilt Sampling efter 24, 48 og 72 timer af dyrkning

1. Tage 50 ml sterilt dyrkningsmedium i en flakon rør.
2. Anvendes prøven til bestemmelse af biomasse tørvægt, β-fructofuranosidasen aktivitet og mikroskopisk analyse.

3. Bestemmelse af biomasse tør vægt efter 24, 48 og 72 timer af dyrkning

1. Biomasse prøverne skal tages mindst i to eksemplarer.
2. Vægt en cellulose filter med en lille målestok efter tørring i ekssikkator og placere filteret i en Buchner tragt med tilsluttet vandstrålevakuum pumpe.
3. Filtrere en defineret prøvevolumen (fx 10 ml) ennd skylles filteret med 10 ml deioniseret vand for at fjerne medium forbindelser fra biomassen.
4. Wrinkle filteret en gang i midten, placere den i et glas petriskål og sætte det ind i et rum tørretumbler, indtil vægten konstans (mindst 24 timer).
5. Afkøl filteret i en ekssikkator og vejning.
6. Beregn biomassen tørvægt som forskellen mellem vægten af ​​filteret med og uden tørrede biomasse divideret med den anvendte prøvevolumen.

4. Bestemmelse af den ekstracellulære enzymatiske aktivitet af β-fructofuranosidasen ved GOD / POD-essay efter 24, 48 og 72 timer af dyrkning

Opbevar prøverne på is hele tiden, mens du arbejder med dem.

1. Filter 1,5 ml kultur suspension via et celluloseacetatfilter ved at trykke kulturen suspensionen med en sprøjte gennem filteret ind i et reaktionsrør. Opbevares reaktionsrøret ved -20 ° C indtil brug.
2. Til reaktionsblandingen anvende 20uL prøve, og der tilsættes 200 pi 1,65 M saccharose opløst i 0,05 M phosphatpuffer (pH 5,4) for at initiere reaktionen fra saccharose til glucose. Cary af reaktionen mindst in duplo.
3. Inkuberes reaktionsblandingen ved 40 ° C i 20 minutter i en varmeblok. Stop reaktionen efter inkubering ved 95 ° C i 10 minutter i en varmeblok. Reaktionsblandingen afkøles ved at lagre den på is og dreje ned kondenserede vand ved centrifugering ved 13,000 g i 10 minutter ved 4 ° C.
4. Redegøre pH og temperatur afhængig spaltning af saccharose til glucose, foretage en blindværdi ved hjælp 20 ul deioniseret vand i stedet for 20 uL prøve.
5. At tegne sig for restglucose i dyrkningsmediet foretage en negativ kontrol for hver prøve. Til dette formål anvendes 20 pi af prøven og inaktivere β-fructofuranosidasen ved opvarmning til 95 ° C i 10 minutter forud for tilsæt saccharose og inkuberes som beskrevet i trin 4.3.
6. Fortynd prøverne, således at følgende foranstaltaktionen, kan måles adsorption i det kalibrerede værdiområde.
7. Udfører alle enzymatiske analyser i tre eksemplarer. Anvend 2 pi fortyndet prøve i en mikro-titer plade godt. Anvende en standard område for kalibrering på mikro-titer pladen ved hver anvendelse af 2 pi af ti glucoseopløsninger med ti forskellige know koncentrationer (fra 1 mM til 15 mM) i stedet for 2 uL prøve. For nulpunkt kalibrering bruge 2 ul deioniseret vand i stedet for 2 pi prøve.
8. Tilsæt 200 pi af reagens til hver brønd ved anvendelse af en multi pipette.
9. Inkubere blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur.
10. Opbevar mikro titerplade ved 6 ° C indtil måling (nogle få timer højst).
11. Måle absorptionen ved 450 nm under anvendelse af en 96-brønds Sunrise mikro-pladelæser og Magellan datasøgningssystemet software. Indstille blandetid på op til 5 sek. og resten perioden op til 1 sek.
12. Åbn resultatet diagrammet med et regneark og konstruere en kalibrering linje ved hjælp af standard sortiment:
    glucose koncentration = a X absorption + b
    
13. Beregn aktiviteten:
    aktivitet = (absorption X fortyndingsfaktoren-tom værdi) X a + b
    
14. Finde ud af β-fructofuranosidase aktivitet ved at beregne forskellen mellem aktiviteter af prøven og en passende negative kontrol.
15. Beregne den specifikke produktivitet for således anvendelse ved at tage hensyn biomasse tørvægt og β-fructofuranosidasen aktivitet ^11.

5. Mikroskopi og Automatisk billede analyse efter 72 timer af dyrkningen

1. Sted omkring 3 ml kultur suspension i en plast Petri-skål ogfortynde dem med fysiologisk natriumchloridopløsning, indtil de morfologiske struktur adskilles.
2. Placerer petriskålen under et mikroskop, som har en indbygget eller tilsluttet kamera. Anskaf og spare omkring 100 billeder (figur 2) af morfologiske strukturer pr prøve. Være opmærksom på, at på hvert billede mindst ét ​​objekt fuldstændigt afbildet.
3. Åbn alle billeder af den samme prøve med billedet behandlingsprogram ImageJ ^12. Konvertere billeder til sort og hvid ved anvendelse af fremgangsmåden værktøj "Afgiv Binary" (figur 2). Til påføring af kommando til hel række af billeder anvende en makrokode som følger.
   kører (,, Make Binary ")
   
4. Åbne forarbejdede binære billeder med ImageJ igen. Beregn formfaktorer Féret diameter, projiceret areal, omkreds, cirkularitet, aspect ratio, rundhed und soliditet for hvert billede med analysere værktøj "Set måling". For at anvende kommando til en Series af billeder bruger en makro kode som følger.
   køres ("8-bit");
   kører ("Make Binary");
   kører ("Set Scale ...", "distance = X kendt = 1000 pixel = 1 enhed = um global");
   kører ("Set Målinger ...", "område omkreds form Féret sin grænse display omdirigerer = Ingen decimal = 3");
   kører ("Analyser Partikler ...", "size = 10000-Infinity cirkularitet = 0,00-1,00 show = Outlines display");
   Bestemme X som antallet af pixels, som korrelerer til 1000 um ved at konstruere en lige linie over en skala bar. Korrelere antallet af pixels i lige linie med længden af ​​Målestokken i um.
5. Åbn resultatet diagrammet indeholder formfaktoren værdier for hvert billede med et regneark. Beregn en morfologi, nummer som følger for hvert billede.
   
6. Beregn middelværdi og standardafvigelse for morfologi nummeret under hensyntagen til alle billeder på en prøve. Anvender en plotning og dataanalyse for grafisk korrelation af morfologien tal med den specifikke produktivitet og bestemme den matematiske relation ved matematisk regressionsanalyse.

6. Repræsentative resultater

Ved tilsætning af talkum mikropartikler A. niger SKAN 1015 morfologi ændres fra en sand pellet morfologi til en dispergeret eller mycelie morfologi. Henviser pellet morfologi er udstillet på standardbetingelser en mycelial morfologi skabes ved supplering af mediet med 10 g / L af talkum mikropartikler (figur 4).. Samtidig aktiviteten af β-fructofuranosidasen forøger omkring 3 gange ^3-5. En supplering af en eller 3 g / L af talkum fører til en dispergeret morfologi, med en dobbelt fructofuranosidase aktivitet (figur 4)..

Mikro partikel afhængige morfologi kan udførligt beskrevet af Morphology nummer, som kan beregnes ved hjælp af parametre bestemt ved automatisk billedanalyse. Perfekt runde og glatte pellets vil i mikroskopiske billeder vises som perfekte cirkler. For sådanne partikler morfologi antallet har en værdi af 1. Det mindste fragment af mycelial morfologi kan forenkles som en en-dimensional linie giver en morfologi række 0. Alle mellemliggende morfologiske former som aflange uregelmæssige pellets eller klumper vil derfor have værdier mellem 0 og 1. Forholdsvis store partikler vil resultere i en høj, fungale partikler med en stor overflade eller aflange partikler i en forholdsvis lav morfologi nummer ^11.

Under standardbetingelser morfologien i reaktoren 1 udviser en morfologi række omkring 0,8. Morfologien i reaktoren 4 med 10 g / L talkum har et Mn omkring 0,1. Morfologien Antallet af reaktorer 2 og 3, med talkum koncentrationer på 1 og 3 g / L, ligger mellem disse to ekstremer viser en dispergeret morphonologi. Idet mikro partikel afhængig morfologi er tæt forbundet med β-fructofuranosidasen produktivitet, er en matematisk korrelation af morfologi antal og produktivitet svarer til figur 5 opnået.

Figur 1. Overordnet arrangement af den eksperimentelle design og den analytiske procedure. A. niger dyrkes (med eller uden mikro-partikler) i en 3 L omrørt tank bioreaktor i 72 timer. Efter 24 er 48 og 72 ha udtaget til bestemmelse af biomasse tørvægt og β-fructofuranosidasen aktivitet, som igen anvendes til beregning af den specifikke produktivitet. Efter 48 h fungale morfologi undersøgt ved mikroskopi og karakteriseret ved digitalt billede analyse. Relevante parametre for billedanalyse kombineres til en morfologi nummer, som er matematisk korreleret med den specifikke produktivitet.

Figur 2. Trin i billedbehandling for mikroskopisk-genererede billeder af morfologiske strukturer fra A. niger. Trin 1: image erhvervelse af mikroskop. Trin 2: image forbedres, hvis det er nødvendigt. Trin 3: image binarisering, sort-hvid (binært) billede genereret i ImageJ. Trin 4: det binære billede behandles med og uønsket objekt fjernes. Trin 5: morfologisk analyse er gennemført med "Analyze partikler" funktion af open source programmet ImageJ.

Figur 3. Forskellige morfologiske former A. niger afhængig af koncentrationen af tilsat mikropartikler. Med stigende koncentration af mikropartikler tilsat pelleten størrelse kan nøjagtigt reduceres til små kerne-skal-pellets, små flokke og endog frit dispergeret mycelium. Morfologi engineering af Aspergillus niger SKAn1015 af mikro-partikler tilskud i nedsænket kultur. Uden mikropartikler (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) og 40-50 g / L (T). Billeder blev taget ved lysmikroskopi efter 72 timer af dyrkning.

Figur 4. Fructofuranosidasen aktivitet i afhængighed af talkum mikro partikelkoncentration 1 g / L (reaktor 2), 3 g / L (reaktor 3) og 10 g / L (reaktor 4). Reaktor 1 er ikke suppleret med mikropartikler, her dyrkningen udføres under standardbetingelser.

Figur 5 Repræsentative god korrelation ^(R2 = 0,91) i morfologiAntallet og den specifikke produktivitet. Morfologien nummer er afbildet (abscissen) mod specifikke produktivitet (ordinat). Lineær regression giver den eksponentielle korrelation.

Discussion

Ændringen af ​​svampe morfologi har været af interesse for bioteknologi, da mange årtier. Forskellige undersøgelser har forsøgt at variere udvalgte procesparametre såsom pH-værdi, strømtilførsel, temperatur, medium næringsstoffer eller inokulumkoncentration ^1, men lider ikke unøjagtig og ufuldstændig kontrol morfologi, høje energiomkostninger, hæmmende virkning eller produkt ustabilitet, I modsætning hertil tilskud af mikropartikler muliggør en nøjagtig manipulation af fungal morfologi gennem finjusteres variation af partikelstørrelsen og koncentration. Dette åbner nye muligheder for at anvende mikropartikler, til optimering og skræddersyet udformning af højt producerende morfologi i bioteknologisk produktion med A. niger og andre filamentøse mikroorganismer.

Det digitale billede Analysen er en nem reproducerbar metode til at karakterisere svampe makro morfologi. Imidlertid forskellige parametre for størrelse, form og overflade kendetegnetter af morfologiske strukturer beskrevet i litteraturen gør hurtig vurdering af svampe kompliceret morfologi. Det præsenteret Morfologi nummer som en kombination af relevante parametre, undgår denne mangel, og kan bruges ikke kun for omfattende karakterisering af morfologiske strukturer, men også for direkte matematisk sammenhæng med produktiviteten. Denne gang gør en vurdering af produktivitet ved given morfologi og derfor en tilpasning af morfologi for processen skal muligt.

Ved hjælp af morfologi nummeret, er det muligt at skelne mellem forskellige pellet og klump morfologier ^4,5. For yderligere udvikling af morfologi antal behandlingen af ​​den fraktale dimension synes at være lovende. En fraktal dimension giver en måling af kompleksiteten og masse fylde egenskaber af et objekt ¹³ og er derfor prædestineret for en helhedsorienteret karakterisering af mycelie morfologi.

Creation af en højt producerende mycelial morfologi, men kan føre til problemer med fremgangsmåden ydeevne, især i stor skala dyrkning, da mycelievækst form har tidligere vist sig at udvise meget større dyrkningsmedium viskositeter ^2. Dette fører til problemer med varme-og masseoverførsel, og dannelsen af stillestående ikke blandede zoner, der kræver en højere indgangseffekt og for dyrkning dyrere at drive ^en. Derfor er forholdet mellem svampe morfologi og kultur bouillon viskositet bør overvejes, når du ændrer morfologi og indarbejdes i yderligere modeller.