のカスタマイズアスペルギルスニジェールモルフォロジー

Summary

正確に生成すると総合的に糸状菌の形態を特徴づけるための方法

Abstract

糸状菌A.ニジェールは、食品から医薬品業界への工業的プロセスの広い範囲で広く使われている株である。この糸状菌の中で最も魅力的な、しばしば手に負えない特徴の一つは、その複雑な形態です。それは緻密な球状ペレットから粘性の菌糸体（ 図1）の範囲である。さまざまなプロセスパラメータと成分は菌類の形態¹に影響^を与えること^が知られています。最適な生産性は、特定の形態学的形態と強く相関するので、菌の形態は、多くの工業生産の生産性のボトルネックを表しています。

正確に形態学的形状を制御するために、まっすぐ進むと、エレガントなアプローチでは、増加した酵素の生産^2-6貢献培地に無機不溶性微粒子（含水ケイ酸マグネシウム、酸化アルミニウムやチタン、ケイ酸、酸化など）の追加です。 OBVがあるので、マイクロ粒子依存の形態と酵素生産との間のIOUの相関は、それが数学的に生産性と形態学的外観をリンクすることが望ましい。したがって、定量的な正確かつ包括的な形態学的な説明は、対象としています。

そこで、生成し、特徴づけるミクロ粒子に依存する形態学的構造を、おそらく糸状微生物の形態形成の理解に貢献する生産性（図1）真菌の形態を相互に関連付ける方法を提案する。

組換え株のA.ニジェール SKAn1015はタンクリアクターの攪拌3 Lで72時間栽培されています。 g / Lの事前接種に1グラム/ L、3グラム/ Lと10の濃度タルク微粒子の添加により形態学的構造の様々な再現性が生成されます。滅菌した試料は、酵素生産の成長の進捗状況や活動を決定するための24時間、48時間および72時間後に採取されています。ザ形成された製品は、高付加価値酵素β-フラクトフラノシダーゼ、中でもグルコース^7-9ショ糖の反応を触媒する食品や製薬業界におけるネオ糖形成のための重要な生体触媒である。したがって、ショ糖を加えた後、グルコースの定量化は、生産β-フラクトフラノシダーゼの量を意味します。グルコースの定量は、96ウェルマイクロタイタープレートでハイスループット分析のために変更されたGOD / POD-アッセイ¹⁰によって行われます。

72時間後の菌の形態を顕微鏡で調べ、デジタル画像解析によって特徴付けられる。そうすることで、フェレの直径、投影面積、周囲長、円形度、アスペクト比、真円度のundの堅実さのような真菌のマクロ形態の粒子の形状因子は、オープンソースの画像処理プログラムImageJを用いて計算されています。関連するパラメータは、包括的な特性評価を可能にする無次元形態番号（Mn）が¹¹に結合され真菌の形態。形態番号と生産の密接な相関関係は、数学的回帰で強調表示されます。

Protocol

1。栽培の原子炉のセットアップおよび開始

合計4つのバイオリアクターの栽培が行われています。

1. Aの栽培に2.2 Lの作業ボリュームで3 L攪拌タンクバイオリアクターを使用して、 ニジェール SKAn1015。
2. 反応器に72.6グラムのグルコース一水和物を注ぐと1.9 Lの脱イオン水でそれを埋める。
3. 例えば、3バッフル、2つの6枚羽根ディスクタービンインペラ、pH電極、エアフィルター、冷却指、エアフィルター、エアフィルターの無菌サンプリングのための液浸管と排気クーラーガス入口として原子炉装置の設置培地、接種、酸と塩基およびインレットホース。
4. 20分間121℃で反応をオートクレーブ。
5. 酸 - 塩基貯蔵（2 M塩酸、2 M水酸化ナトリウム）とそれに対応するポンプを原子炉に接続し、pH制御ユニットと5.0のpH値±0.05を設定します。
6. 冷却水システムで原子炉をリンクし、加熱ジャケットを置く原子炉容器の周り。
7. 対応する制御ユニットと温度センサーを取り付け、37の温度を設定±0.1℃の温度制御ユニットで。
8. 原子炉の上に攪拌モータに合わせて、200 min ^-1の撹拌速度でサービスにそれを持って来る。
9. 滅菌インレットホースの滅菌最小限の成長媒体¹¹トラフ1（250 mL）を追加します。培地調製のためのすべてのコンポーネントが20分間121℃でオートクレーブと一緒に混合した。 3栽培のためのコンポーネントが1グラム/ L（原子炉2）、3グラム/ L（原子炉3）と10グラム/ L（原子炉4）の濃度タルク粉末（3MgO•4SiO _{2•H 2} O）が含まれています。使用する前に、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）のマイクロ粒子を再懸濁および滅菌培地に追加します。コントロール培養で（粒子なし）の50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）によるマイクロ粒子懸濁液を交換してください。
10. 胞子懸濁液（接種）を追加sはウーハーペニヒらに用意しました。ら^（2011）11そのトラフ滅菌インレットホース（50 mL）の1その1X10 ^{6 mLの-1}に胞子量の濃度。接種は、栽培開始（H = 0 h）をマークします。
11. 1.0 L min ^-1の速度で通気を開始します。

2。 24、48、72栽培の時間後に無菌サンプリング

1. 小瓶チューブに無菌培養液50mLを取る。
2. バイオマス乾燥重量、β-フラクトフラノシダーゼ活性の測定と顕微鏡分析用のサンプルを使用しています。

3。 24時間、48時間および72時間後の栽培バイオマス乾燥重量の測定

1. バイオマス試料は、少なくとも二重に取られることです。
2. 重量デシケーター中で乾燥後、マイクロスケールのセルロースフィルターと接続された水ジェット真空ポンプをブフナー漏斗にフィルタを配置します。
3. 定義されたサンプル量（例えば10 mL）でフィルタリングndはバイオマスから培地化合物を除去するために10 mLの脱イオン水でフィルターを洗浄してください。
4. しわフィルタ一度途中で、ガラスのペトリ皿に入れて体重不変（少なくとも24時間）までコンパートメント乾燥機に入れます。
5. デシケーター中でフィルタを冷却して重量を測定します。
6. 使用されるサンプルの体積で割った乾燥バイオマスの有無にかかわらず、フィルタの重量の差としてバイオマス乾燥重量を計算します。

4。 24時間後GOD / POD-エッセイによるβ-フラクトフラノシダーゼの細胞外酵素活性の測定、48、栽培の72時間

一緒に働きながら常に氷上でサンプルを格納します。

1. フィルタ1.5 mLの培養懸濁液トラフ反応管にフィルターを介して注射器で培養懸濁液を押すことにより、セルロースアセテートフィルター。使用するまで-20℃で反応管を格納します。
2. 反応混合物の使用20サンプルμLおよびスクロースからグルコースへの反応を開始するには0.05 Mリン酸緩衝液（pH 5.4）に溶解した1.65 Mショ糖の200μLを追加します。少なくとも複製に反応出キャリー。
3. 加熱ブロックで20分間40℃で反応混合物をインキュベートします。加熱ブロックで10分間95℃でインキュベートして反応を停止します。氷の上にそれを格納することによって、反応混合物を冷却し、4℃で10分間13.000グラムで遠心分離によって凝縮水をスピンダウン℃に
4. pHとグルコース、ショ糖の温度依存性の切断を考慮して、20μLの脱イオン水の代わりに、20μLのサンプルを使用してブランク値を実施しています。
5. 培養液中の残存グルコースを考慮して、各サンプルの負の制御を行う。そのエンドユーザーによる使用20種類のサンプルのμL及びスクロースを追加し、ステップ4.3で説明をインキュベートする前に、10分間95°Cで加熱することによりβ-フラクトフラノシダーゼを失活させた。
6. 次のような測定そのサンプルの希釈ured吸着は、キャリブレーション値の範囲内です。
7. 三重のすべての酵素アッセイを実施しています。ウェルマイクロタイタープレートに2μL希釈したサンプルを適用します。代わりに2μLのサンプルの10個の異なるノウハウ濃度（1 mMから15 mMまで）で10グルコース溶液2μLを使用して、それぞれがマイクロタイタープレート上に校正用の標準の範囲を適用します。ゼロ点の校正は、2μL脱イオン水の代わりに2μLのサンプルを使用しています。
8. マルチピペットを用いて各ウェルに試薬溶液200μLを追加します。
9. 室温で10分間混合物をインキュベートします。
10. 6でマイクロタイタープレートを保存する度測定（最大で数時間）までC。
11. 96ウェルサンライズマイクロプレートリーダーとマゼランのデータ検索ソフトウェアを使用して450nmにおける吸収を測定します。最大5秒まで混合時間を設定します。最大1秒までと残りの期間。
12. スプレッドシートと結果チャートを開き、標準の範囲を使用して検量線を作成する：
    グラムlucose濃度= 1 X + bの吸収
    
13. アクティビティを計算します。
    活動=（吸収X希釈因子ブランク値）X A + B
    
14. サンプルの活動と適切なネガティブコントロールとの差を計算することによって、β-フラクトフラノシダーゼの活性を把握する。
15. アカウントバイオマス乾燥重量とβ-フラクトフラノシダーゼ活性を¹¹にとることによって次のように使用するための特定の生産性を計算します。

5。栽培の72時間後に顕微鏡や自動画像解析

1. 場所は約3 mLの培養プラスチックペトリ皿中の懸濁液と形態学的構造が分離されるまで、生理食塩水でそれらを希釈してください。
2. 内蔵または接続されているカメラを備えて顕微鏡下でペトリ皿を置く。サンプルあたりの形態構造の約100の画像（ 図2）を取得して保存します。各画像に少なくとも一つのオブジェクトが完全に描かれていることに注意を払う。
3. 画像処理プログラムImageJは¹²と同じサンプルのすべての画像を開きます。プロセスツールの"Makeバイナリ"（ 図2）を使用して白黒に画像を変換します。画像のシリーズ全体にコマンドを適用するため、次のようにマクロのコードを使用します。
   実行（、、バイナリを作る"）
   
4. 再びImageJを使用して処理バイナリイメージを開きます。形状因子フェレの直径、投影面積、周囲長、円形度、アスペクト比、分析ツールの "Set測定"を持つすべてのイメージのための真円度のundの堅牢性を計算します。セリにコマンドを適用するための画像のESは、次のようにマクロのコードを使用します。
   ラン（ "8ビット"）;
   ラン（ "バイナリを作成します"）;
   実行（ "SETスケール..."、 "距離= X知られている= 1000ピクセル= 1単位=ミクロングローバル"）;
   （ "セットの測定..."、 "領域境界形状フェレの上限の表示は=なしの小数= 3をリダイレクトする"を参照）を実行;
   （ "粒子を分析..."、 "サイズ= 10000無限の真円度= 0.00から1.00のshow =表示をアウトライン"）を実行します。
   スケールバーを越えて直線を作成することにより、1000μmのに相関画素数としてXを決定します。 μmの中のスケールバーの長さの直線の画素数を関連付けることができます。
5. スプレッドシートと各画像の形状係数の値を含む結果チャートを開きます。画像ごとに次のように形態の数を計算します。
   
6. の値と考慮つのサンプルのすべての画像を取って形態番号の標準偏差を意味します計算します。 特定の生産性モルフォロジー数のグラフィカルな相関のグラフとデータ解析プログラムを使用して、数学的回帰による数学的関係を決定します。

6。代表的な結果

タルク微粒子Aの追加によりニジェール SKAn 1015形態が真のペレット形態から分散した、あるいは菌糸の形態に変更されます。ペレットの形態は、標準的な条件で展示されているのに対し、菌糸形態がタルク微粒子の10グラム/ L（ 図4）と培地の補充によって作成されます。同時にβ-フラクトフラノシダーゼの活性は3倍^3から5の周りに増加します。タルク粉末の1または3 g / Lの補充は倍増フラクトフラノシダーゼ活性（ 図4）と、分散した形態につながる。

マイクロ粒子依存形態を包括的にモルによって記述することができる自動画像解析によって決定されるパラメータを使用して計算することができます。phology番号を指定します。完璧なラウンドと滑らかなペレットは顕微鏡画像で完全な円として表示されます。このような粒子のために形態番号が1の値を持ちます。菌糸形態の最小フラグメント0の形態の番号を得、一次元のラインのように簡略化することができます。細長い不規則なペレットまたは塊のようなすべての中間の形態学的形態は、したがって、0と1の間の値を持ちます。かなり大きな粒子はかなり低い形態番号¹¹で、大規模な表面または細長い粒子と高い、真菌の粒子になります。

標準状態で原子炉1の形態は、展示約0.8モルフォロジー番号を入力します。 10グラム/ Lタルク粉末を反応器4の形態は、0.1の周りにMnを備えています。 1と3 g / Lのタルク粉濃度の原子炉2および3の形態の数は、分散したモルフォを実証し、これらの両極端の間にあるでれっと。ミクロ粒子に依存する形態が密接にβ-フラクトフラノシダーゼの生産性と関連しているので、形態の番号と図5と同様の生産性の数学的な相関が得られます。

図1実験デザインと分析手順の全体的なスキーム。A.ニジェールは、72時間タンクバイオリアクターの攪拌3 Lに（微小粒子の有無にかかわらず）栽培されています。 24時間後、48と72ヘクタールのサンプルは再び、特定の生産性の計算に使用されているバイオマス乾燥重量とβ-フラクトフラノシダーゼの活性の測定のために取られています。 48時間後に菌の形態を顕微鏡で検査され、デジタル画像解析を特徴とする。画像解析の関連するパラメータは、数学的な特定の生産性と相関している形態の番号に結合されています。

図2：Aから形態学的構造の微視的生成された画像の画像処理のステップニジェール 。ステップ1：顕微鏡による画像取得。ステップ2：イメージの改善、必要に応じて。ステップ3：Ima​​geJのでは生成された画像の二値化、白黒（バイナリ）の画像。ステップ4：バイナリイメージによって処理され、不要なオブジェクトがクリアされます。ステップ5：形態素解析は、オープンソースプログラムImageJの "分析粒子"関数を使って行われている。

図3。 A.別の形態形追加されたマイクロ粒子の濃度に依存するニジェール 。微小粒子の濃度の増加とともにペレットのサイズは正確に小さなコア·シェル型ペレット、小さな群れも自由に分散した菌糸体にまで減少させることができるようにした。としての形態エンジニアリング液内培養におけるマイクロ粒子補給によってpergillusニジェールSKAn1015。微粒子（）は10 mg / L（B）、0.1グラム/ L（C）、0.2グラム/ L（D）、0.3グラム/ L（E）、0.6グラム/ L（F）、1.0グラム/ Lなし（G）、1.5グラム/ L（H）、2.0グラム/ L（I）、2.5グラム/ L（J）、3.0グラム/ L（K）、3.5グラム/ L（L）、4.0グラム/ L（M ）、4.5グラム/ L（N）、5.0グラム/ L（O）、10グラム/ L（P）、15グラム/ L（Q）、20グラム/ L（R）、30グラム/ L（S）と40〜50グラム/ L（T）。画像は、栽培の72時間後に光学顕微鏡で撮影された。

図4の依存性のフラクトフラノシダーゼ活性のタルク微粒子濃度を1g / L（原子炉2）、3グラム/ L（原子炉3）と10グラム/ L（原子炉4）。原子炉1は、微小粒子を添加したされていません。ここで栽培は、標準的な条件下で実施されています。

図5の形態の代表的な良好な相関（R ² = 0.91）番号と特定の生産性。形態番号は、特定の生産性（縦軸）に対して（横軸）にプロットされています。非線形回帰は指数の相関が得られます。

Discussion

菌類の形態の変更は数十年以来、バイオテクノロジーで注目されている。別の研究では、対照的に、pH値、電源入力、温度、培地の栄養素や接種濃度¹として選択されたプロセスパラメータを変更しようとしたが、形態のむしろ不正確、不完全なコントロールに苦しんで、高いエネルギーコスト、抑制効果や製品の不安定ましたマイクロ粒子の補充は、粒子サイズと濃度の微調整の変動を介して菌の形態の正確なエンジニアリングを可能にします。これは、最適化のためにとAと生物工学的生産で高い生産形態のオーダーメイド設計のためのミクロ粒子を使用する新たな可能性を開きます。 ニジェールや他の糸状微生物。

デジタル画像解析は、真菌マクロ形態を特徴づけるための簡単​​な再現可能な方法です。しかし、サイズ、形状、表面特性のパラメータの様々な文献に記載されている形態学的構造のTERは、真菌形態の迅速な評価は複雑になります。関連するパラメータの組み合わせとして提示形態番号は、この欠点を回避し、形態学的構造の総合的特性評価のためだけでなく、生産性との直接的な数学の相関だけでなく、使用することができます。これが再び与えられた形態によって生産性の推定をレンダリングするため、プロセスの形態のカスタマイズが可能必要があります。

形態番号を使用して、それは様々なペレットと塊の形態^4,5とを区別することが可能です。形態数の更なる発展のためにフラクタル次元の検討は有望と思われる。フラクタル次元は、オブジェクト¹³のプロパティを充填複雑さと質量の測定を提供し、したがって、菌糸形態の全体的な特徴付けのためにあらかじめ定めています。

CR菌糸生長フォームは以前にはるかに大きいの培養液の粘度^2を示すことが示されているため、高い生産菌糸形態のeationは、しかし、特に大規模栽培でのプロセスのパフォーマンスの問題につながる可能性があります。これは、熱伝達や物質移動と高い電源入力を必要とし^、1を動作させる栽培を行うとコストが高く停滞し、非混合ゾーンの形成の問題につながります。したがって、真菌の形態と培養液の粘度との関係は、形態を変更するときに考慮する必要がありますし、さらにモデルに組み込まれる。